中國人群腺苷脫氨酶2缺乏癥致病基因攜帶者篩查

閆露露，樓碧瑩，徐文蓉，李海波

中國人群腺苷脫氨酶2缺乏癥致病基因攜帶者篩查

閆露露1，樓碧瑩2，徐文蓉3，李海波1

1.寧波市婦女兒童醫(yī)院出生缺陷綜合防治實(shí)驗(yàn)室，浙江寧波 315000；2.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)部，浙江寧波 315000；3.北京智因東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心有限公司，北京 100023

分析中國人群腺苷脫氨酶2缺乏癥（deficiency of adenosine deaminase 2，DADA2）致病基因頻率，為有效開展中國人群DADA2的防控和干預(yù)工作提供依據(jù)。回顧性分析2015年1月至2021年1月于北京智因東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心有限公司進(jìn)行全外顯子組測序的11.1萬例原始數(shù)據(jù)，對基因致病和可能致病性突變進(jìn)行攜帶者篩查，分析基因雜合突變的類型和等位基因頻率。發(fā)現(xiàn)29種基因致病和可能致病性雜合突變，其中6種[c.730G>T（p.E244X）、c.1049_c.1061delAGCTGCCTTACTT（p.K350Tfs*14）、c.940A>T（p.K314X）、c.1239+2（IVS8）T>C、c.1240-1（IVS8）G>A、c.1087C>T（p.Q363X）]既往未見報(bào)道，等位基因累計(jì)頻率為0.58%。人群基因頻率最高的為p.F355L（0.5%），其次為p.Y453C（0.014%）和p.P193L（0.013%），其他26種位點(diǎn)均小于0.01%，為罕見突變位點(diǎn)。通過篩查豐富了基因突變譜，明確了中國地區(qū)人群的基因突變的攜帶率約1/171，推測中國人群的DADA2患病率約1/116 964。

腺苷脫氨酶2缺乏癥；基因；等位基因頻率；患病率

腺苷脫氨酶2缺乏癥（deficiency of adenosine deaminase 2，DADA2）是一種罕見的常染色體隱性自身炎癥性疾病，由基因純合或復(fù)合雜合突變導(dǎo)致，臨床表現(xiàn)為自身炎癥反應(yīng)綜合征、卒中反復(fù)發(fā)作、類似結(jié)節(jié)性動脈炎的血管炎及免疫缺陷等[1-2]。迄今累計(jì)報(bào)道病例約300多例[3]。Infevers數(shù)據(jù)庫目前共收錄104種基因致病和可能致病性突變，其中大多突變類型為錯(cuò)義突變、無義突變和剪接突變。目前DADA2的治療主要是使用腫瘤壞死因子抑制劑（tumor necrosis factor inhibitor，TNFi）。一旦確診，應(yīng)盡早應(yīng)用TNFi以減輕或避免神經(jīng)系統(tǒng)損傷。對血液病或TNFi難治性患者建議應(yīng)用造血干細(xì)胞移植[4-6]。有研究報(bào)道DADA2的患病率約1/222000[7]。但我國人群DADA2的研究報(bào)道甚少，臨床上對其認(rèn)識有限，患者可能因未及時(shí)診斷錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)。因此，本研究基于中國人群大樣本的全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES）數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性分析，以了解中國人群DADA2的患病率和致病基因突變攜帶情況，為制訂有效可行的DADA2防控策略提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2015年1月至2021年1月北京智因東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心有限公司的11.1萬例WES原始數(shù)據(jù)，篩查內(nèi)容及范圍為基因致病和可能致病性突變位點(diǎn)，排除臨床意義未明或良性突變位點(diǎn)。本研究經(jīng)寧波市婦女兒童醫(yī)院倫理委員會審查通過（倫理審批號：[2019]倫審字（41）號）。

1.2 研究方法

Fastq格式的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行fastp（0.23.1）質(zhì)控，去除接頭、低質(zhì)量reads等處理后，以GRCH37/hg19基因組版本為依據(jù)進(jìn)行突變檢測及注釋。利用BWA0.7.17軟件將測序序列與GRCH37/hg19基因組版本比對，使用GATK3.70軟件獲取單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）和插入缺失。利用ANNOVAR和Vep軟件進(jìn)行突變注釋，根據(jù)突變的類型、普通人群頻率注釋（如ExAC、ESP、GnomAD等）及HGMD、OMIM、ClinVar等數(shù)據(jù)庫的關(guān)聯(lián)注釋，篩選出致病和可能致病性突變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

某種突變的陽性檢出例數(shù)除以所有入組人群數(shù)量，得出該突變的人群等位基因頻率。使用哈迪–溫伯格平衡檢驗(yàn)，估計(jì)疾病的患病率。

2 結(jié)果

2.1 ADA2基因攜帶情況分析

在11.1萬例WES數(shù)據(jù)中，共檢出29種基因致病和可能致病性雜合突變，等位基因累計(jì)頻率為0.58%，各篩查位點(diǎn)的攜帶情況見表1。其中錯(cuò)義突變占比最高，達(dá)55.17%（16/29）；其次為無義突變，占24.14%（7/29）；移碼突變占13.79%（4/29），剪接突變占6.90%（2/29）。等位基因頻率位于前十的突變分別為c.1065C>A（p.F355L）、c.1358A>G（p.Y453C）、c.578C>T（p.P193L）、c.97_c.98insA（p.T33Nfs*29）、c.139G>C（p.G47R）、c.916C>T（p.R306X）、c.1069G>A（p.A357T）、c.278T>C（p.I93T）、c.25C>T（p.R9W）和c.139G>T（p.G47W），其中等位基因頻率最高的突變?yōu)閏.1065C>A（p.F355L），達(dá)0.5%，其次為c.1358A>G（p.Y453C）（0.014%），c.578C>T（p.P193L）（0.013%），上述3個(gè)突變攜帶者人數(shù)占所有雜合攜帶者人數(shù)的78.81%（372/472）。其余26種突變均為罕見突變，等位基因頻率遠(yuǎn)小于0.01%。

2.2 ADA2基因突變分布情況

29種基因致病和可能致病突變中，有2種為剪接突變，位于8號內(nèi)含子，其余27種均位于不同的外顯子上。后者中70.37%位于ADA2蛋白的催化結(jié)構(gòu)域，p.M1T和p.R9W位于ADA2蛋白的N端信號肽，p.R45W、p.G47V、p.G47W、p.G47R位于ADA2蛋白的二聚結(jié)構(gòu)域，但本研究并未發(fā)現(xiàn)位于PRB結(jié)構(gòu)域上的相關(guān)突變，見圖1。

3 討論

DADA2是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，于2014年由Zhou等[1]首次報(bào)道。該病典型的臨床特征包括發(fā)熱、結(jié)節(jié)性動脈炎、網(wǎng)狀青斑、早發(fā)型卒中和免疫缺陷。DADA2的臨床異質(zhì)性很大，患者通常在兒童期發(fā)病，從發(fā)現(xiàn)到確診往往需要很長的時(shí)間。目前國內(nèi)已報(bào)道41例DADA2患者，年齡范圍為9天至25.6歲，平均診斷年齡7.25歲，該病臨床表現(xiàn)多樣，反復(fù)發(fā)熱和皮膚受累是DADA2最常見的特征[6,8-13]。41例患者中有37例存在反復(fù)發(fā)熱，87.80%的患者存在皮膚受累，皮膚表現(xiàn)最常見的特征為結(jié)節(jié)紅斑病、網(wǎng)狀青斑、口腔潰瘍和手指壞疽，高于國外報(bào)道，可能與種族差異及國內(nèi)目前報(bào)道病例較少有關(guān)[1]。神經(jīng)系統(tǒng)病變是DADA2患者的另一個(gè)主要特征，41例患者中有25例出現(xiàn)缺血性或出血性卒中。其他常見特征包括關(guān)節(jié)炎/關(guān)節(jié)痛、肝脾大。其他不常見的特征包括心肌炎、肌肉無力和肌炎。41例患者中有3例因感染或器官衰竭死亡，死亡率7.32%，與其他報(bào)道相似[14-15]。國內(nèi)DADA2患者絕大部分在10歲前發(fā)病，多數(shù)患者存在不同程度的器官受累，因此，對兒童期出現(xiàn)發(fā)熱、早發(fā)性卒中反復(fù)發(fā)作、系統(tǒng)性血管炎、免疫缺陷等病變的患兒應(yīng)考慮DADA2，盡早進(jìn)行血漿ADA2酶活性和基因檢測。

基因位于染色體22q11.1，包含10個(gè)外顯子，編碼一種由髓細(xì)胞分泌的細(xì)胞外酶，主要在活化的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞上表達(dá)[1-2]。ADA2是一種具有四個(gè)結(jié)構(gòu)域的二聚酶，包括N端的信號肽、二聚結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域和推定受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域[16]。研究表明缺乏可導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，破壞血管壁完整性，導(dǎo)致炎癥和血管損傷[1,17]。DADA2是為數(shù)不多的可治療的自身免疫性疾病，對中國人群DADA2患病率的評估暫無文獻(xiàn)報(bào)道，因此對基因致病突變攜帶者的篩查尤為重要，可通過了解人群基因的等位基因頻率，評估人群中DADA2的發(fā)病率，進(jìn)而為DADA2的診斷防治提供理論依據(jù)。

表1 11.1萬例WES數(shù)據(jù)分析ADA2基因突變攜帶情況

注：AF為等位基因頻率；P為致病的；LP為可能致病的

注：紅色為未見報(bào)道的新突變

目前發(fā)現(xiàn)的基因致病突變種類多樣，均分布在10個(gè)外顯子中。檢索ClinVar和Infevers數(shù)據(jù)庫，共發(fā)現(xiàn)120個(gè)基因可能致病和致病性突變，其中主要為錯(cuò)義突變，占60%（72/120），移碼突變占17.5%（21/120），無義突變占8.3%（10/120）。已報(bào)道的DADA2患者多為復(fù)合雜合突變。研究表明p.G47R、p.G47A、p.R169Q和p.Y453C等突變?yōu)樽畛Ｒ姷闹虏∥稽c(diǎn)[1-2]。這些突變可能改變ADA2蛋白受體結(jié)合域，影響蛋白的二聚化、催化活性和分泌，并進(jìn)一步誘發(fā)DADA2的疾病表型。p.G47R純合突變常見于格魯吉亞?猶太和土耳其人群，該突變在格魯吉亞–猶太人群的攜帶率為10.2%，在土耳其人群為2%[1-2,18]。p.R169Q主要見于芬蘭、荷蘭和比利時(shí)人群，其在芬蘭人群的攜帶率最高，為1/160，患病率約1/103 217；p.T360在意大利人群中較為常見，而p.Y453C則是最常見的泛民族突變體[19]。盡管在格魯吉亞–猶太人群中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)部分DADA2患者，但考慮到p.G47R在該人群中高比例的攜帶率，很可能有一部分患者未得到及時(shí)的診斷。

本研究結(jié)果顯示基因致病突變在中國人群的累計(jì)等位基因頻率為0.58%，共發(fā)現(xiàn)29種基因致病突變。其中僅p.F355L的等位基因頻率達(dá)到0.5%，該位點(diǎn)可能為中國人群的突變熱點(diǎn)，且該突變在東亞人群中的基因頻率為0.28%。Hashem等[4]曾在一名DADA2患者中發(fā)現(xiàn)p.F355L/p.E328K復(fù)合雜合突變。p.Y453C在中國人群等位基因頻率為0.0142%，該突變在國外比較常見；Caorsi等[16]報(bào)道過3例DADA2患兒均為基因復(fù)合雜合突變，表現(xiàn)出DADA2特征性的臨床表現(xiàn)，包括發(fā)熱、網(wǎng)狀青斑、出血性卒中、肝大和全血細(xì)胞減少等。青島發(fā)現(xiàn)一例p.Y453C純合突變患兒，臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)熱、脾大和脂膜炎，但無血液系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)異常[13]。p.P193L在中國人群的基因頻率為0.013%，Belot等[20]在一個(gè)法國DADA2男性患者中發(fā)現(xiàn)基因p.P193L/ p.R169Q復(fù)合雜合突變，患者表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)熱并伴有口腔潰瘍和關(guān)節(jié)疼痛、結(jié)節(jié)性多動脈炎、缺血性卒中和頸內(nèi)動脈狹窄等臨床特征，其哥哥28歲時(shí)死亡，表現(xiàn)為終生炎癥特征，包括腿部活動性病變和四肢壞死等。c.97_c.98insA（p.T33Nfs*29）為移碼突變，在中國人群的等位基因頻率為0.008%，該突變暫無文獻(xiàn)報(bào)道。c.139G>C（p.G47R）在中國人群的基因頻率為0.006%，有多篇文獻(xiàn)報(bào)道在不同種族中發(fā)現(xiàn)p.G47R純合和復(fù)合雜合突變[2,21-22]。

p.R306X為無義突變，其在中國人群等位基因頻率為0.0036%，Garg等[21]曾報(bào)道1例患有嚴(yán)重血管疾病的5歲土耳其女孩攜帶p.R306X/p.G47R復(fù)合雜合突變。c.1069G>A（p.A357T）在中國人群等位基因頻率為0.0036%，Poswar等[22]報(bào)道1例p.A357T純合突變的12歲患者，表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)熱、潰瘍、網(wǎng)狀青斑、中腦梗死和椎動脈瘤等。c.278T>C（p.I93T）在中國人群等位基因頻率為0.0027%，2014年Zhou首次在一名15歲的英國男孩中發(fā)現(xiàn)p.Ile93Thr/p.Met1Thr復(fù)合雜合突變，患兒有反復(fù)發(fā)熱、腔隙性腦梗死和皮膚表現(xiàn)，最終死于并發(fā)癥[1]。c.25C>T（p.R9W）在中國人群等位基因頻率為0.0027%，有文獻(xiàn)報(bào)道1例攜帶p.R9W/p.Gl47A復(fù)合雜合突變，表現(xiàn)為發(fā)熱、疼痛的皮下結(jié)節(jié)、腦膜炎和腦干梗死等[22]。p.G47W在中國人群等位基因頻率為0.0027%，Barron等[23]曾報(bào)道1例攜帶G47W/R169Q復(fù)合雜合的DADA2患兒，臨床表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞減少、菌血癥，急性移植物抗宿主病。此外，本研究發(fā)現(xiàn)6種國內(nèi)外暫無文獻(xiàn)報(bào)道的基因雜合突變，即c.730G>T（p.E244X）、c.1049_c.1061delAGCTGCCTTACTT（p.K350Tfs*14）、c.940A>T（p.K314X）、c.1239+2（IVS8）T>C、c.1240-1（IVS8）G>A、c.1087C>T（p.Q363X），上述突變的等位基因頻率均遠(yuǎn)小于0.01%，為罕見突變位點(diǎn)，豐富了基因突變譜。

單基因疾病的患病率可通過人群中報(bào)告的有害突變的總等位基因頻率來估計(jì)，有研究通過人群WES數(shù)據(jù)估計(jì)疾病的患病率[24]。因此，筆者通過中國人群的大樣本的WES數(shù)據(jù)分析中國人群致病基因頻率可獲得更精準(zhǔn)的DADA2患病率。根據(jù)本文分析結(jié)果，推測我國人群基因的攜帶率約1/171，DADA2的患病率約1/116 964，比Jee等[7]通過整合gnomAD數(shù)據(jù)庫（超過14萬人的基因組數(shù)據(jù)）中突變的等位基因頻率和致病突變的功能數(shù)據(jù)得出的患病率要高，可能原因是樣本量和種族差異所致。中國人口近14億，理論上DADA2患者約11 969人，考慮到DADA2外顯不全和表現(xiàn)度差異性等，有相當(dāng)數(shù)量的DADA2患者仍未被及時(shí)診斷，嚴(yán)重阻礙DADA2防治能力的提升。本文通過篩查中國人群的致病等位基因頻率情況，估計(jì)的DADA2發(fā)病率可為制訂中國人群DADA2的預(yù)防計(jì)劃提供有價(jià)值的參考。

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Screening for carriers of pathogenic gene for deficiency of adenosine deaminase 2 in China

YAN Lulu, LOU Biying, XU Wenrong, LI Haibo

1.Laboratory of Birth Defects Prevention and Control, Ningbo Women & Children’s Hospital, Ningbo 315000, Zhejiang, China; 2.Medical School, Ningbo University, Ningbo 315000, Zhejiang, China; 3.Chigene (Beijing) Translational Medical Research Center Co. Ltd., Beijing, 100023

To analyze frequency of pathogenic gene for deficiency of adenosine deaminase 2 (DADA2) in China, so as to provide basis for effective prevention and intervention of DADA2.The original data of 111 000 subjects of whole exome sequencing performed in Chigene (Beijing) Translational Medical Research Center Co. Ltd. from January 2015 to January 2021 were retrospectively analyzed. The types of variants and allele frequency ofgene were analyzed.29 heterozygous variants ofgene were found. There were 6variants unreported previously, including c.730G>T (p.E244X), c.1049_c.1061delAGCTGCCTTACTT(p.K350Tfs*14), c.940A>T(p.K314X), c.1239+2(IVS8)T>C, c.1240-1(IVS8)G>A, c.1087C>T(p.Q363X), and the cumulative allele frequency ofwas 0.58%. The highest allele frequency of p.F355L was 0.5%, followed by p.Y453C (0.014%) and p.P193L (0.013%). Other 26 variant sites were less than 0.01%, indicating rare variant.It enriched the variational spectrum ofgene by the screening. The carrier frequency ofgene in China population was about 1 in 171 individuals, corresponding to an expected DADA2 disease prevalence of 1 in 116 964 individuals.

Deficiency of adenosine deaminase 2;gene; Allele frequency; Prevalence

R593.2

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.25.005

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2020KY890）；寧波市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2022S035）；寧波市醫(yī)療衛(wèi)生高端團(tuán)隊(duì)重大攻堅(jiān)項(xiàng)目（2022020405）

李海波，電子信箱：lihaibo-775@163.com

（2023–03–19）

（2023–08–19）