市售雙氯芬酸鈉腸溶片質量分析與雜質風險評價

何積芬，黃國健，李沃強，呂冠欣

1.國家藥品監督管理局藥物代謝研究與評價重點實驗室，廣東 廣州 510515；2.佛山市順德區藥品檢驗所，廣東 佛山528300

雙氯芬酸鈉（diclofenac sodium）又名雙氯滅痛，屬于第三代強效非甾體抗炎藥，其作用機制是通過抑制前列腺素的合成與釋放，達到減輕疼痛的目的，具有抗炎、鎮痛和解熱的效果［1］。市售雙氯芬酸鈉的口服制劑通常為腸溶制劑，以解決其酸不穩定性和對胃黏膜的刺激性，通過片芯或微丸包腸衣的方式來降低藥物的不良反應［2-3］。雙氯芬酸鈉腸溶片以其藥效強、劑量小、不良反應輕、個體差異小的優勢，在骨科各類輕中度急慢性疼痛的臨床治療中應用廣泛［4］，是抗炎鎮痛類藥物的典型代表之一。為提高藥品監管的有效性和針對性，本研究收集了市售29 批雙氯芬酸鈉腸溶片，涉及生產企業9 家。按照《中國藥典》2020 年版二部［5］對樣品進行檢驗，從溶出曲線分析不同廠家樣品與原研樣品的體外溶出行為的差異。同時，建立了雙氯芬酸鈉潛在風險雜質的定量分析方法并通過了方法學驗證，用新建立的雜質定量分析方法測得的雜質個數和雜質總量大于藥典有關物質測定結果，部分樣品甚至出現了不合格情況，提示部分企業生產的雙氯芬酸鈉腸溶片存在較大質量風險，并為藥典有關物質方法的改進提供了思路。

1 材料

1.1 儀器

天大天發RC-806 藥物溶出儀、SOTAX AT7 smart 自動溶出儀、島津UV-2700 紫外-可見分光光度計、賽默飛U-3000 高效液相色譜儀、梅特勒AG-204 萬分之一電子天平、賽多利斯BT 125D十萬分之一電子天平、上海精宏DHG-9076A 電熱恒溫鼓風干燥箱、上海精密WFH-203B 紫外分析儀。

1.2 藥品與試劑

雙氯芬酸鈉對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100334-201803，純度：100.0%）；雙氯芬酸鈉雜質A 對照品、雜質C 對照品、雜質E 對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：100395-200301、510124-201501、510120-201501）；雙氯芬酸鈉雜質B 對照品（QUALITY CONTROL CHEMICALS INS，批 號：06-DEC-20-02，純 度：98.79%）；29 批市售雙氯芬酸鈉腸溶片均為25 mg規格，涉及9 個生產廠家；甲醇為色譜純，磷酸二氫鈉、磷酸鈉、氫氧化鈉、冰醋酸、鹽酸、磷酸、過氧化氫溶液等試劑均為分析純，以純化水作為實驗用水。

2 方法與結果

2.1 樣品概況

雙氯芬酸鈉腸溶片原研廠家為諾華制藥，進口本地化產品由北京諾華制藥有限公司生產，商品名為扶他林。自1986 年首次在我國投放市場以來，雙氯芬酸鈉腸溶片得到了廣泛應用，生產企業眾多。截至2022 年12 月，國家藥品監督管理局網站（www.nmpa.gov.cn）藥品數據庫顯示，雙氯芬酸鈉腸溶片有194 個藥品批準文號，有25 mg 和50 mg 兩個制劑規格。本次收集的29 批樣品均為25 mg 規格，涵蓋了9 個生產廠家［其中A 廠家（原研企業北京諾華）8 批，B 廠家8 批，C 廠家4 批，D 廠家3 批，E 廠家2 批，其余F、G、H、I 廠家各1 批］，分別來自藥品零售藥店、連鎖藥店、批發企業和醫療機構，檢驗標準全部執行《中國藥典》2020 年版二部。

2.2 依標準檢驗結果

雙氯芬酸鈉原料及腸溶片均為《中國藥典》收載品種，2015 年版和2020 年版檢驗標準一致。依照藥典標準對29 批雙氯芬酸鈉腸溶片進行檢驗，其中性狀、鑒別、重量差異和含量測定等項目均符合標準規定，未發現明顯的質量風險。

2.2.1 有關物質采用HPLC 自身對照法測定有關物質，標準規定相對雙氯芬酸峰保留時間1.2～1.3 處的雜質Ⅲ校正后不得大于0.5%，其他單個雜質不得大于0.5%，各雜質的和（雜質Ⅲ按校正后計）不得大于1.0%。本次檢驗29 批樣品中雜質Ⅲ校正后含量在0.001%～0.379%之間，其他單個雜質在0.018%～0.421%之間，總雜質（雜質Ⅲ按校正后計）在0.047%～0.985%之間。由于標準中未規定色譜柱型號、柱長等信息，采用不同品牌規格的C18 柱分析29 批樣品，雜質Ⅲ的相對保留時間在1.22～1.36 之間。因此，采用相對保留時間來確定雜質Ⅲ，存在定位不準確的可能。同時，發現B廠家樣品的總雜質含量普遍高于其他廠家，最高達到0.985%，接近標準規定的限值。方法采用等度洗脫，色譜圖記錄至主峰保留時間的2 倍，存在部分雜質不能完全檢出的情況。因此，藥典中的有關物質方法還需進一步改進，以更好地評價雙氯芬酸鈉腸溶片的雜質風險。

2.2.2 溶出度標準規定，雙氯芬酸鈉腸溶片在酸中的溶出量應不大于標示量的10%，在緩沖液中的溶出量應不小于標示量的70%。29 批樣品的酸中溶出度結果均較理想，沒有明顯差異；緩沖液中平均溶出量B 廠家為103.4%，A 廠家為100.5%，C 廠家為97.3%。與A 廠家原研藥相比，B 廠家的平均溶出量明顯偏高，且同一批6 片溶出量的RSD%在0.5%～7.6%之間，不同批次間的重復性差異較大，表明該廠家產品質量存在不穩定的情況。

仿制藥企業的檢驗結果在有關物質和溶出量兩個項目上與原研企業呈現較大差異，且存在同一企業不同批次的產品質量不穩定的情況，部分甚至接近標準規定的限值。為深入分析雙氯芬酸鈉腸溶片的質量風險，對9 個廠家的樣品從溶出曲線和雜質定量分析兩方面進行了探索性研究。

2.3 溶出曲線分析

2.3.1 方法的選擇根據《口服固體制劑溶出度試驗技術指導原則》《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導原則》的規定，應至少選擇3 種pH值的溶出介質進行溶出曲線考察［6-7］。但是，考慮到雙氯芬酸鈉的溶解度呈現pH 依賴性，在酸性介質中溶解降低；腸溶包衣在水中120 min 不被破損，導致主成分無法溶出；制劑不經酸性介質階段，在pH6.8 的磷酸鹽介質中的溶出速度更快等特點［8-9］，最終選擇經0.1 mol/L 鹽酸溶液試驗2 h 后，以1 000 mL 磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）作為溶出介質，轉速為100 r/min，經5、10、15、20、30、45 和60 min 時，取溶液10 mL 并即時補充相同體積的溶出介質，照紫外-可見分光光度法測定吸光度，波長選擇276 nm，按外標法計算每片的溶出量。

2.3.2 結果分析9 家企業的樣品照上述方法試驗，繪制溶出曲線，各企業溶出曲線與A 廠家生產的原研藥比較見圖1。由試驗結果可知，雙氯芬酸鈉腸溶片在pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液中，存在時間為5 min～10 min 不等的溶出滯后現象。樣品在第一個時間點的溶出度RSD 達到20%以上，第二個時間點的溶出度RSD 超過10%，導致溶出曲線與非模型依賴相似因子（f2）法的要求不相符。A 廠家原研藥在15 min 的溶出度大于85%，可認為藥物制劑的生物利用度不受溶出行為的限制，即制劑的行為與溶液相應，而仿制藥溶出度達到85%的時間在5 min 至45 min 不等，尤其是B 廠家與F 廠家樣品的溶出行為與A 廠家樣品存在較大差異。

圖1 樣品溶出曲線圖

2.4 雜質定量分析

《中國藥典》標準對雜質Ⅲ的限值做了單獨規定，雙氯芬酸鈉雜質B 即為《中國藥典》標準中的雜質Ⅲ。有研究利用DEREK 的基因毒性警示結構來分析雜質B 的危害，認為雜質B 屬于警示結構中的醛類物質，可能與DNA 上的氨基產生加成反應，從而對DNA 存在潛在的烷基化影響［10-12］，因此該雜質值得我們著重關注。上述研究又采用MTT 法對各雜質的細胞毒性IC50值進行測定，結果顯示雜質B 的毒性最高，進一步印證了基因毒性的預測結果。該研究對雜質進行溯源分析，發現雜質B 是雙氯芬酸鈉制劑在水分或光照等因素的影響下，氧化歧化降解的產物。因此，本研究針對潛在風險物質雜質B 建立了定量測定方法。

2.4.1 色譜條件色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse plus-C8 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：40 ℃；以甲醇為流動相A，磷酸鹽緩沖液（稱取0.8 g 磷酸二氫鈉和0.5 g 磷酸，加水1 000 mL 溶解，用磷酸調節pH 值至2.5）為流動相B，梯度洗脫程序見表1；流速為1.0 mL/min；檢測波長為254 nm。

表1 梯度洗脫程序

2.4.2 溶液的制備將雙氯芬酸鈉腸溶片研細，取約相當于雙氯芬酸鈉50 mg 的細粉，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加70%甲醇適量，超聲使主成分溶解，用上述溶劑稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液作為供試品溶液。

取雙氯芬酸鈉雜質B 對照品，精密稱定，以70%甲醇為溶劑，超聲溶解后，定量稀釋成濃度約為1 μg/mL 的對照品溶液。

2.4.3 方法學驗證（1）專屬性。分別取雙氯芬酸鈉對照品和雜質A、B、C、E 對照品適量，精密稱定，用70%甲醇溶解于同一量瓶中，并稀釋制成每1 mL中各約含10 μg 的混合溶液，作為系統適用性溶液。取20 μL 注入液相色譜儀，結果見圖2A，雙氯芬酸鈉及各雜質峰之間符合完全分離的要求。稱取約相當于雙氯芬酸鈉50 mg 的樣品細粉5 份，分別置于50 mL 量瓶中，制備破壞實驗樣品：①加入1 mol/L鹽酸溶液2 mL，放置2 h，加1 mol/L 的氫氧化鈉溶液2 mL；②加入1 mol/L 的氫氧化鈉溶液2 mL，放置2 h，加1 mol/L 的鹽酸溶液2 mL；③加30%過氧化氫2 mL，放置2 h；④置150 ℃加熱4 h；⑤置254 nm 紫外燈下照射3 h。樣品經上述破壞實驗后，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，離心，取上清液分別作為酸破壞、堿破壞、氧化破壞、熱破壞以及光照破壞的樣品溶液。分別取上述溶液20 μL 進樣分析，結果表明產生的降解雜質均能與主成分峰較好分離，見圖2B～F，本方法的專屬性良好。

圖2 專屬性考察HPLC圖：A.系統適用性；B.酸破壞；C.堿破壞；D.氧化破壞；E.熱破壞；F.光照破壞

（2）線性關系和檢出限（LOD）。精密稱取雙氯芬酸鈉雜質B 對照品10.27 mg，用70%甲醇溶解并分別稀釋制成濃度分別為0.10、0.51、1.01、2.03、5.07、20.29 μg/mL 的系列標準溶液，按“2.4.1”項下色譜條件測定，以對照品溶液的濃度作為橫坐標（X），峰面積作為縱坐標（Y），繪制標準曲線，計算回歸方程為Y=0.736 4X-0.017 8（r=0.999 9）。結果表明，在0.10～20.29 μg/mL 范圍內，雜質B 的濃度與峰面積呈良好的線性關系。取上述標準溶液適量，用70%甲醇稀釋制成0.03 μg/mL 的檢出限溶液，測得色譜峰的信噪比為5.6，因此雜質B 的檢出限為0.03 μg/mL。

（3）準確度。取雙氯芬酸鈉雜質B 對照品適量，精密稱定，用70%甲醇制成標準儲備液。稱取樣品適量，照“2.4.2”項下方法分別制備供試品溶液6 份，加入雜質B 儲備液適量，使加入的對照品濃度約為1.0 μg/mL，分別進樣分析，計算回收率和RSD，結果見表2。

表2 準確度考察結果

（4）重復性。取A 廠家樣品，照“2.4.2”項下供試品溶液制備方法，平行制備6 份供試品溶液，照“2.4.1”項下的色譜條件進樣分析，測得雜質B平均含量為71.5 μg/g，RSD 為0.8%，表明方法重復性良好。

（5）供試品溶液穩定性。取供試品溶液，于0、4、8、12、24 h 分別進樣分析，雜質B 峰面積的RSD 為1.5%，表明供試品溶液中雜質B 在24 h內穩定。

3 討論

目前該品種法定檢驗標準中有關物質項采用等度洗脫方法且未明確色譜型號、柱長等信息，以相對保留時間定位雜質Ⅲ，采用自身對照法計算含量，對不同廠家雙氯芬酸鈉腸溶片的質量區分力不強。雜質B 具有潛在的毒性風險，建議采用外標法以雜質對照品對其進行定性和定量測定。將本研究建立的雜質B 定量測定方法應用于雙氯芬酸鈉腸溶片有關物質分析，發現新建立的方法采用梯度洗脫且分析時間更長，對各雜質有更好的分離，各廠家樣品中檢出的雜質個數均多于《中國藥典》法定檢驗方法測得的雜質個數。此外，B 廠家的部分樣品用《中國藥典》方法測得的總雜質含量雖然合格，但是接近標準規定的限值，最高達到0.985%。而用新建立的雜質定量測定方法測得的總雜質量大于標準規定限值1.0%，最高達到1.278%。對比兩種測定方法，B 廠家8 批樣品以自身對照法計算的總雜質含量，見表3。結果進一步提示了部分廠家樣品的質量風險和有關物質測定方法優化的必要性。

表3 B廠家8批樣品總雜質含量（自身對照法）

4 結論

本研究從溶出度和有關物質兩方面考察了市售雙氯芬酸鈉腸溶片仿制藥與原研藥的質量差異，并對雜質風險進行了評估。研究結果顯示多個廠家的雙氯芬酸鈉腸溶片與原研藥的溶出行為存在較大差異。體外溶出度可預測藥物的體內行為，是口服固體制劑的重要評價指標。若仿制藥的體外溶出行為與原研藥差異較大，則可能會對療效的一致性產生影響，存在一定的質量風險。部分企業樣品的總雜質含量偏高且接近標準限值；同一企業不同批次產品的雜質種類和含量也呈現差異。建議對現行《中國藥典》雙氯芬酸鈉腸溶片標準中的有關物質方法進行優化，采用梯度洗脫方法，以外標法對潛在毒性雜質進行嚴格控制，以提高對藥品的質量標準，促進企業優化制劑工藝，確保藥品的安全性。