紫陀螺菌液體深層發酵培養基的篩選

譚愛華 劉 璐 肖 倩 李方橋

（1湖北三峽職業技術學院，湖北 宜昌 443000；2三峽大學生物與制藥學院天然產物研究與利用湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 430002）

紫陀螺菌Gomphus purpuraceus，屬擔子菌亞門Basidiomycotina、非褶菌目Aphyllophorales、陀螺菌科Gomphaceae、陀螺菌屬Gomphus，是生長在闊葉混交林地的一種外生菌根菌，常在夏秋季形成子實體[1]。1999年7月，筆者首次在三峽地區西陵峽河谷區發現紫陀螺菌[2]，后研究發現紫陀螺菌在甘肅、云南、貴州、四川等部分地區也有生長[2]。紫陀螺菌鮮菇肉質脆嫩，味道鮮美，營養豐富，干制后香味獨特，是一種極具營養價值的珍稀食用菌[3]。紫陀螺菌含有豐富的蛋白質、氨基酸、維生素、糖類以及微量元素等[3-8]，具有較高的研究價值和開發潛力。紫陀螺菌目前尚未實現人工栽培，只能采集野生資源，而紫陀螺菌需要與松科或殼斗科等木本植物共生，且需共生宿主植物長大到一定年限后才能穩定出菇，產量也極易受降雨量等環境因素的影響[1-9]。為有效開發利用紫陀螺菌，采用液體深層發酵的方式在較短時間內獲得較多的菌絲體是一種更加便捷的方法。因此，筆者在紫陀螺菌生態研究[9]、菌種分離[10-12]的基礎上，進行大量的培養基篩選試驗[2，13-14]。為篩選獲得最佳液體深層發酵配方，筆者主要采用均勻設計法，以紫陀螺菌的菌絲體生物量為指標，并用高效液相色譜分析最佳配方和初始配方的發酵液產物豐富度，進一步證實最佳配方的有效性，為紫陀螺菌進一步研究提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株及培養基

供試菌株為Gp01，由采自西陵峽河谷區的野生子實體分離純化所得，保藏于中國典型培養物保藏中心（武漢），保藏號為CCTCCM2021376。

斜面及平板培養基配方：去皮馬鈴薯250 g，瓊脂16 g，葡萄糖20 g，蛋白胨9 g，磷酸二氫鉀0.5 g，水1 000 mL。種用液體培養基配方：去皮馬鈴薯250 g，葡萄糖20 g，蛋白胨9 g，磷酸二氫鉀0.5 g，水1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 液體深層發酵培養基配方篩選試驗設計

將斜面菌種接種至平板培養基上，于23 ℃恒溫培養至菌落直徑為3～4 cm 時備用。配制液體培養基，分裝于500 mL 三角瓶，并于121 ℃、0.11 MPa 壓力下滅菌30 min 后冷卻備用。將經活化的平板菌落外緣菌絲切碎后直接接入三角瓶中，置于磁力攪拌器上，轉速為900 r/min、溫度為23 ℃，恒溫振蕩培養直至菌液濃稠，在菌種轉接前24 h 再利用1 500 r/min的轉速將菌液攪碎呈均勻的菌漿備用。

選取馬鈴薯X1、葡萄糖X2、蛋白胨X3、磷酸二氫鉀X4、磷酸氫二鉀X5、硫酸鎂X6作為均勻設計的參試因素，每因素設7 個水平（表1），以菌絲體生物量為目標函數（Y），采用均勻設計法U7（76）篩選深層發酵培養基配方[15-16]。

表1 試驗因素和水平表單位：g/L

將去皮的馬鈴薯切塊、煮沸20 min 后用六層紗布過濾，取其濾液，按試驗設計配制培養基。使用250 mL 三角瓶各自分裝100 mL，每個處理3 個重復，于121 ℃、0.11 MPa 壓力下滅菌30 min 后冷卻備用。吸取液體菌種（菌漿）8 mL 分別接入搖瓶中。將搖瓶置于23 ℃、150 r/min 的恒溫振蕩器中連續振蕩培養15 d。

深層發酵后的發酵液過濾（孔徑為0.178 μm），濾出的菌絲體用純水沖洗2～3 遍后，取出置于培養皿中，于40 ℃的烘箱內烘干至恒重，精確稱量后計算干重，再換算成每1 000 mL發酵液中的菌絲體干重。

1.2.2 高效液相色譜（HPLC）法驗證優化

將篩選出的最佳液體深層發酵培養基和初始種用液體培養基進行驗證，每個培養基3次重復，接種方法、接種量、培養方法同1.2.1。

用紗布分別過濾發酵液中的菌絲體后，每個培養基發酵液各取20 mL，經乙酸乙酯萃取3 次，使用旋轉蒸發儀減壓濃縮得到浸提物樣本。

每個浸提物樣本分別用0.5 mL 70%乙腈溶解，經0.22 mm 濾膜過濾后上樣分析。HPLC 分析色譜柱為YMC-Pack ODS-A 系列C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），0.1%冰乙酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B，進行梯度洗脫（0-40 min，B/A：10%→90%；40-55 min，B/A：90%→100%；55-75 min，B/A：100%→100%），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長為254 nm，進樣量10 μL。

1.3 數據分析

采用DPS V7.05對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 最佳配方的篩選結果

2.1.1 結果統計及回歸方程的構建與分析

培養后的發酵液較濃稠，其中菌絲體呈現絮狀、條狀、片狀、球狀等形態。各處理獲得的菌絲體生物量見表2。由表2 可知，水平7 即配方7 的菌絲體生物量最高。

表2 試驗設計及生物量單位：g/L

用DPS v7.05 對數據進行二次多項式逐步回歸分析所得回歸方程為：

對回歸方程進行檢驗，計算得出相關系數R2等于1.000 0，F值為99 999.850 0，剩余標準差SSE等于0.005 4。回歸方程的顯著性水平P值為0.002 4，P值小于0.01，達到0.01 的極顯著水平，結果表明該方程可信度較高。

2.1.2 回歸項的回歸系數t檢驗

由表3 可知，方程中X2（葡萄糖）的P值為0.000 1、X（3蛋白胨）的平方項P值為0.000 1、X（1馬鈴薯）與X（5磷酸氫二鉀）的P值為0.000 7、X（2葡萄糖）與X（3蛋白胨）的P值為0.002 4、X（3蛋白胨）與X5（磷酸氫二鉀）的P值為0.000 1，可看出上述各項P值均小于0.01，全部達到極顯著水平，說明方程中引入的各項因素對菌絲體生物量均有影響。

表3 各項回歸項的回歸系數檢驗結果

由表4 可知，各水平的觀測值與擬合值的數值差極小，另外，試驗組的最大擬合誤差絕對值也僅為0.0043，說明通過回歸方程擬合的菌絲體生物量數值與實際的試驗數值基本一致，也可進一步證明上述構建的回歸方程的準確性。

表4 各水平的觀測值、擬合值和擬合誤差

2.1.3 配方優化

通過DPS v7.05進行回歸分析，并通過數學模型得到紫陀螺菌液體深層發酵培養基的理論最優組合，將其與組間最優水平（配方7）進行對比驗證（表5），獲得理論最優配方，且菌絲體生物量為17.357 4 g/L。

表5 配方優化驗證單位：g/L

2.2 發酵液成分分析

由圖1 可知，最優培養發酵的色譜圖和初始種用液體培養基發酵的色譜圖完全不同，且前者比后者具有更多的出峰點。結果表明，最優培養基的紫陀螺菌發酵液成分比初始種用液體培養基配方更豐富，從而得出構建的理論最優配方可使紫陀螺菌發酵得更充分。

圖1 紫陀螺菌發酵液的HPLC圖譜（波長為254 nm）

3 小結與討論

試驗構建紫陀螺菌的最佳液體深層發酵培養基配方：去皮馬鈴薯298 g，葡萄糖30 g，蛋白胨12 g，磷酸二氫鉀1.2 g，硫酸鎂0.2 g，水1 000 mL。再通過高效液相色譜法對比分析最佳配方和初始種用配方的發酵液成分，得出最佳配方紫陀螺菌發酵液能產生更多更豐富的發酵成分。這為紫陀螺菌在醫藥上應用提供了一些理論支撐，今后可進一步研究人工馴化紫陀螺菌的深層發酵及其產物。