烙灸介導Wnt信號通路對脊髓損傷大鼠內源性神經干細胞增殖分化影響

夏 鉑 范 靈

寧夏醫科大學，寧夏 銀川 750004

脊髓損傷作為一種嚴重創傷性事件，在交通、勞動及運動事故中較為常見，導致中樞神經系統致殘損傷。常造成損傷部位以下運動、感覺等功能不可逆轉喪失，同時引起肌肉萎縮、壓瘡、感染，嚴重導致呼吸障礙[1-2]。脊髓損傷臨床手段很多，如手術療法、大劑量激素沖擊療法、理療康復等[3]。但損傷后中樞神經細胞完全恢復很難，這些治療方法只能減少繼發性脊髓損傷發生，防止脊髓功能進一步惡化，恢復不了已損傷神經恢復功能。因此，研發一些行之有效治療促進脊髓損傷處神經細胞修復再生，以恢復脊髓結構及功能是臨床急需解決問題。烙灸是脊髓損傷一種新療法，臨床已經取得一定療效。前期觀察烙灸對脊髓損傷大鼠Wnt信號通路作用。發現烙灸能激活Wnt信號通路[4]，而Wnt信號通路能促進多種來源干細胞發生神經分化[5]。此外，Wnt信號通路是調控內源性神經干細胞主要通路[6]。本人提出烙灸激活脊髓損傷大鼠Wnt信號通路，促進其內源性神經干細胞增殖分化為神經元細胞，同時抑制分化為星形膠質細胞，使其神經細胞修復再生。為驗證假說，故設計本實驗，揭示其機理，為臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年雄性(Sprague Dawley，SD)大鼠50只，SPF級，體質量240～290 g，來自寧夏醫科大學實驗動物中心。大鼠在安靜環境下飼養，給予充足飼養和飲用水，室溫20～22 ℃，相對濕度45%，保持動物房內晝夜節律。動物實驗嚴格遵循3R原則。實驗方案經寧夏醫科大學倫理研究原著委員會批準。

1.1.2 試劑 與儀器巢蛋白抗體(Nestin，DF7754，Affinity)，神經膠質纖維酸性蛋白抗體(Glial Fibrillary Acidic Protein，#80788，Cell Signaling Technology)，封閉液(濃縮型正常山羊血清，中杉金橋)，光學顯微鏡 (LEICA，德國)、Image-lab圖像分析系統和Image-Pro 圖像分析系統(BIORADHERCULES，美國)。石蠟切片機(RM2235，Leica公司，德國)，全波長酶標儀(Epoch，Biotek公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 脊髓損傷模型 大鼠制備除假手術組外，其他4組大鼠均采用水合氯醛腹腔麻醉，俯臥位固定于大鼠固定器上，椎板咬骨鉗咬去T9～T11棘突和椎板，充分露出脊髓組織，避免損傷硬脊膜。運用改良自制Allen’s大鼠脊髓損傷打擊裝置，使打擊棒套入鋼管內，通過砝碼測量打擊棒打擊重量達10 g，打擊高度5 cm，打擊棒自由下落，致使T9～T11節段急性脊髓損傷(不完全性癱大鼠脊髓損傷模型，屬中等程度損傷)。大鼠有擺尾反射，雙下肢癱瘓證實造模成功。假手術組只做椎板切除，不損傷脊髓。術后大鼠分籠，飼養于配有空調專用室，注意術后護理防止感染，每日按壓膀胱區排尿3次，保持墊料干燥。觀察記錄大鼠雙后肢活動情況、立足伸趾能力、回縮反射、大小便等狀態。模型的建立參照《藥理實驗方法學》[7]及相關文獻的方法造模。

1.2.2 實驗分組及造模干預 隨機將50只SD大鼠分為5組，假手術組：只做椎板切除，不做脊髓損傷。模型組：只造模。Wnt抑制劑組：造模成功后12 h給予Wnt抑制劑腹腔注射給藥，每日1次，持續28 d。烙灸組：造模成功后12 h后采用烙灸治療，烙灸組造模后每日同一時間重復治療一次，持續28 d。烙灸聯合Wnt抑制劑組：造模成功后12 h給予Wnt抑制劑腹腔注射給藥，同Wnt抑制劑組，并采用烙灸治療，同烙灸組，持續28 d。烙灸干預：在損傷大鼠兩側夾脊穴(在距損傷上下端兩個椎體棘突間隙旁開距中線3～4 mm處夾脊穴)上，用特制烙灸器，W形薄鐵皮制作灸槽，帶有手柄，依據損傷脊柱長度制作，放于損傷脊柱上，在灸槽內放入艾絨點燃，艾絨加熱傳導鐵器，鐵器傳導患處，使局部發熱，嚴格觀察皮膚情況，造模后每日1次，每次5 min。

1.2.3 標本采集與處理 干預28 d，將大鼠采用全身灌注多聚甲醛取材，以損傷脊髓為中心取縱向離損傷點長約1 cm脊髓，制成石蠟包塊用于免疫組化、免疫熒光檢測損傷組織內源性神經干細胞標記物-神經絲巢蛋白(Nestin)、神經元細胞標記物-神經元特異性稀醇化酶(neuron specific enolase，NSE)和星形膠質細胞標記物-膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)。

1.2.4 脊髓損傷運動功能(basso beattie bresnahan，BBB)評分[8]兩名不知道實驗分組觀察者，于造模后第3天、7天、14天、28天運用BBB運動評定量表評估各組大鼠后肢運動情況，評估指標主要包括各個關節活動情況、跨步能力以及其協調性與軀干平衡能力等，0分(無運動功能)至21分(正常運動功能)，兩人背向評估，平均值是大鼠運動功能最終得分。

1.2.5 免疫組化檢測 將石蠟切片脫蠟入水，經二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水，利用檸檬酸進行微波修復抗原、內源性過氧化物酶阻斷、血清封閉后滴加Nesti(1∶250)，GFAP(1∶400)，β-Catenin(1∶400)和GSK-3β(1∶400)，4 ℃過夜；第2天，PBS漂洗后加入二抗孵育40 min，PBS漂洗后DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，沖洗返藍，脫水、透明、中性樹膠封固，顯微鏡下觀察并拍片。

1.2.6 免疫熒光檢測 切片常規脫蠟至水，將切片置于EDTA抗原修復液，微波爐中高火加熱至沸騰，室溫冷卻5 min后，再中高火加熱3 min，再自然冷卻至室溫。滴加山羊血清封閉液(原液用PBS按1∶9稀釋)，37 ℃孵育30 min。甩去多余液體，不洗。實驗片滴加適當稀釋的一抗，4 ℃過夜。取出后37 ℃復溫30 min，PBS(pH 7.2～7.6)洗5 min，3次。滴加DyLight488熒光素標記羊抗兔IgG，37 ℃ 孵育45 min。PBS(pH 7.2～7.6)洗5 min，3次。滴加DAPI染色液，室溫孵育3 min。PBS(pH 7.2～7.6)清洗。抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡觀察結果及拍照。采用ImageJ軟件分析各個單位視野內大鼠脊髓組織Nestin、NSE、GFAP陽性細胞數。

2 結果

2.1 BBB運動功能評分結果 假手術組大鼠運動功能正常。第3天評分：模型組、Wnt抑制劑組、烙灸組、烙灸聯合Wnt抑制劑組大鼠運動功能評分均小于7分，差異無統計學意義(P>0.05)。第7、14天評分：烙灸組、烙灸聯合Wnt抑制劑組評分高于模型組、Wnt抑制劑組，差異有統計學意義(P<0.05)。Wnt抑制劑組與模型組差異無統計學意義(P>0.05)。第21天評分：烙灸組>烙灸聯合wnt抑制劑組>模型組>Wnt抑制劑組。Wnt抑制劑組與模型組差異無統計學意義(P>0.05)。烙灸聯合Wnt抑制劑組較烙灸組評分降低，差異有統計學意義(P<0.05)；第28天評分：烙灸組最高，Wnt抑制劑組最低，差異有統計學意義(P<0.05)，Wnt抑制劑組與模型組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1，如圖1。

注：與模型組比較，aP<0.05；與wnt抑制劑組比較，bP<0.05；與烙灸組比較，cP<0.05。

表1 各組大鼠損傷后不同時間點BBB評分表

2.2 免疫組化檢測結果 累積光密度值統計假手術組大鼠脊髓組織中Nestin累積光密度值為0。其余4組大鼠脊髓組織中Nestin累積光密度值都較假手術組顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。Wnt抑制劑組與模型組差異無統計學意義(P>0.05)。烙灸組、烙灸聯合Wnt抑制劑組與模型組、Wnt抑制劑組相比明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。烙灸聯合Wnt抑制劑組與烙灸相比明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。模型組、Wnt抑制劑組、烙灸組及烙灸聯合Wnt抑制劑組大鼠脊髓組織中NSE累積光密度值較假手術組顯著減少，尤其是模型組、Wnt抑制劑組減少幅度最大，差異有統計學意義(P<0.05)。Wnt抑制劑組與模型組差異無統計學意義(P>0.05)。烙灸聯合Wnt抑制劑組與烙灸組相比降幅明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。模型組、Wnt抑制劑組、烙灸組及烙灸聯合Wnt抑制劑組大鼠脊髓組織中GFAP累積光密度值較假手術組顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。Wnt抑制劑組與模型組差異無統計學意義(P>0.05)。烙灸組、烙灸聯合Wnt抑制劑組較模型組、Wnt抑制劑組減少，差異有統計學意義(P<0.05)。烙灸聯合Wnt抑制劑組較烙灸組高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2，如圖2。

注：與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與Wnt抑制劑組比較，cP<0.05；與烙灸組比較，dP<0.05。

表2 各組脊髓損傷大鼠Nestin、NSE、GFAP累積光密度比較表

2.3 免疫熒光檢測結果 免疫熒光檢測Nestin、NSE、GFAP陽性細胞數 Nestin、NSE、GFAP陽性細胞呈綠色，形態樹枝狀。Nestin假手術組無陽性細胞。NSE、GFAP假手術組陽性細胞數較多，亮度較亮。其余4組大鼠脊髓組織中Nestin陽性細胞數較假手術組顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。Wnt抑制劑組與模型組差異無統計學意義(P>0.05)。烙灸組、烙灸聯合Wnt抑制劑組與模型組、Wnt抑制劑組相比明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。烙灸聯合Wnt抑制劑組與烙灸組相比明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。模型組、Wnt抑制劑組、烙灸組及烙灸聯合Wnt抑制劑組大鼠脊髓組織中NSE陽性細胞數較假手術組顯著減少，模型組、Wnt抑制劑組減少幅度最大，差異有統計學意義(P<0.05)。Wnt抑制劑組與模型組差異無統計學意義(P>0.05)。烙灸聯合Wnt抑制劑組與烙灸組相比降幅明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。模型組、Wnt抑制劑組、烙灸組及烙灸聯合Wnt抑制劑組大鼠脊髓組織中GFAP陽性細胞數較假手術組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。Wnt抑制劑組與模型組差異無統計學意義(P>0.05)。烙灸組、烙灸聯合Wnt抑制劑組較模型組、Wnt抑制劑組數值減少，差異有統計學意義(P<0.05)。烙灸聯合Wnt抑制劑組較烙灸組高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3，如圖3。

注：與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與Wnt抑制劑組比較，cP<0.05；與烙灸組比較，dP<0.05。

表3 各組脊髓損傷大鼠免疫熒光檢測Nestin、NSE、GFAP陽性細胞數表

3 討論

3.1 關于烙灸治療脊髓損傷研究 脊髓損傷是導致截癱主要原因，全世界平均每年每百萬人中有15～40人發生脊髓損傷。給傷者、家庭及社會帶來沉重負擔，但至今未找到確切、有效治療方法[9]。研究證實脊髓損傷后神經細胞仍存在一定修復再生能力，而成年哺乳動物脊髓損傷后神經很難修復再生。中醫學認為脊髓損傷是督脈損傷，致使氣血逆亂，阻滯經絡，氣血不能溫煦濡養肢體導致氣血不足，筋脈瘀阻。治宜補氣、活血、通絡。烙灸是寧夏少數民族醫學中一種簡單、方便、安全、有效的療法，也是中醫學“化膿灸”發展及延續，其操作比“化膿灸”簡便，其透熱力強，造成皮膚損傷程度小。而脊髓損傷病機是元陽不足，氣滯血瘀，寒凝閉阻經絡致使肢體屈伸不利。需要通過強力熱效應刺激周圍神經敏感度，加強其與大腦中樞神經聯系。烙灸具有強力熱效應，正有此功效。其能夠振奮元陽、溫通經脈、化瘀消腫、寒濕祛濕、通經活絡而調整人體氣機稟性[10]。研究[11]表明，烙灸能夠打開藥物或熱力至皮膚內組織通道，起到消炎、鎮痛、增加血液循環、增強機體代謝作用。前期臨床觀察也證實烙灸治療脊髓損傷患者能明顯提高肌力，促進脊髓損傷患者康復[12]。

3.2 各組大鼠實驗結果 分析前期實驗研究[4]發現，烙灸可以調節Wnt信號通路，對大鼠脊髓損傷后神經具有修復再生作用。本實驗采用BBB運動神經功能評分法、免疫組化、免疫熒光法檢測脊髓損傷大鼠脊髓組織內源性神經干細胞標記物(Nestin)、神經元細胞標記物(NSE)、星形膠質細胞標記物(GFAP)。其中BBB評分法是一種定量、客觀檢測技術，能夠對脊髓損傷作出功能性診斷及定量分析。結果顯示：BBB運動神經功能評分，烙灸組>烙灸聯合Wnt抑制劑組>模型組>Wnt抑制劑組，推斷烙灸組、烙灸聯合wnt抑制劑組效果明顯優于模型組、Wnt抑制劑組，且烙灸組療效最顯著，Wnt抑制劑組與模型組差異無統計學意義(P>0.05)。神經絲巢蛋白(Nestin)是一種細胞骨架蛋白，表達于細胞質中，生存于神經上皮干細胞內，與神經干細胞發育及分化息息相關。其發育期時，Nestin表達逐漸增強，而隨著神經干細胞分化結束，Nestin表達也隨之下降，Nestin被認為是內源性神經干細胞主要標記物之一，檢測Nestin能夠鑒定處于分化期內源性神經干細胞[13]。正常脊髓組織內也存在一定量內源性神經干細胞，在非病理情況下，成年動物(神經細胞分化結束)體內內源性神經干細胞處于“靜止狀態”。研究表明在大鼠出生后6 d脊髓組織中Nestin陽性表達消失。本實驗結果證實，假手術組大鼠脊髓組織中Nestin亦累積光密度值及陽性細胞數為0，表明假手術不會引起內源性神經干細胞激活。而大鼠脊髓損傷后Nestin累積光密度值及陽性細胞數顯著升高，它主要集中在損傷部位，可見脊髓損傷能夠激活內源性神經干細胞，導致內源性神經干細胞向損傷部位遷移。烙灸組大鼠脊髓組織中Nestin累積光密度值及陽性細胞數升高趨勢與模型組相似，但是烙灸組大鼠脊髓組織中Nestin累積光密度值及陽性細胞數都較模型組有顯著升高，可見烙灸能夠促進脊髓損傷后損傷局部內源性神經干細胞激活、遷移與增殖。而Wnt抑制劑組與模型組相比，雖無統計學意義，但Wnt抑制劑組值低于模型組，說明Wnt通路被抑制情況下，內源性神經干細胞激活程度明顯減低。反過來說明激活Wnt通路，有助于內源性神經干細胞激活。烙灸聯合Wnt抑制劑組升高值低于烙灸組，也證實這一點。NSE(神經元特異性稀醇化酶)是神經元細胞特異性標志物，脊髓損傷后大量神經元細胞調亡，如何補充替代缺失神經元細胞是治療關鍵。在脊髓組織自我修復過程中，無外界干預情況下，僅少數內源性神經干細胞會分化為神經元細胞[14]。本實驗結果也證明，損傷引起脊髓組織中NSE累積光密度值及陽性細胞數下降，模型組大鼠脊髓組織NSE累積光密度值及陽性細胞數急速減少，而其經過烙灸治療后，損傷局部NSE累積光密度值及陽性細胞數較模型組顯著升高，表明烙灸組對損傷局部神經元細胞具有促進其修復及增生功效。而Wnt抑制劑組值低于模型組，說明Wnt通路被抑制情況下，神經元細胞修復及增生能力降低。反過來說明激活Wnt通路，可促進神經元細胞修復及增生。烙灸聯合Wnt抑制劑組值低于烙灸組，也證實這一點。GFAP(膠質纖維酸性蛋白)是星形膠質細胞骨架蛋白，和星形膠質細胞運動及形狀調節密切相關，其是星形膠質細胞特異性標記物。發育期時，星形膠質細胞可誘導神經元突起定向生長。成年動物體內星形膠質細胞又具有支持、營養、隔離及保護神經元細胞作用。然而，當中樞神經系統損傷后，星形膠質細胞反應性增生，其過度增生會形成膠質瘢痕，同時分泌抑制性分子，影響神經細胞修復再生[15]。結果顯示，脊髓損傷后局部GFAP累積光密度值及陽性細胞數就顯著增多。而烙灸組GFAP累積光密度值及陽性細胞數損傷后也有增加，但其表達都較模型組顯著減少。據此可知，烙灸可能抑制脊髓損傷后損傷局部星形膠質細胞過度增生，減少瘢痕組織的形成，從而促進軸突再生。而且相關研究[16]已證實，降低GFAP累積光密度值及陽性細胞數能減少膠質瘢痕形成，使軸突得以生長及修復，降低對神經細胞損害，從而促進脊髓損傷大鼠肢體運動功能恢復。而Wnt抑制劑組值高于模型組，說明Wnt通路被抑制情況下，減少膠質瘢痕形成能力減弱。反過來說明激活Wnt通路，可減少膠質瘢痕形成。烙灸聯合Wnt抑制劑組值高于烙灸組，也證實這一點。

綜上所述，烙灸有利于脊髓損傷大鼠神經功能恢復，通過激活脊髓損傷大鼠Wnt信號通路，促進其內源性神經干細胞增殖分化為神經元細胞，同時抑制分化為星形膠質細胞，使其神經細胞修復再生。