壯藥狗蟻草中槲皮素的含量測(cè)定

凌慶輝 陳 路

1.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院藥劑科，廣西 南寧 530003；2.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西 南寧 530023

狗蟻草為豆科鏈莢豆屬植物鏈莢豆Alysicarpusvagnalis(Linn.)DC的干燥根、葉及全草，性平、味甘、苦，具有活血通絡(luò)、駁骨消腫等功效，民間常用于治療慢性肝炎、跌打損傷等疾病[1-3]。文獻(xiàn)研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，目前國(guó)內(nèi)外僅有2篇文獻(xiàn)對(duì)狗蟻草中的化學(xué)成分(水楊酸、胡蘿卜苷、β-谷甾醇)進(jìn)行含量測(cè)定。研究[6]表明槲皮素能夠調(diào)控PI3K/AKT/NF- B信號(hào)通路，改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠的肝臟炎癥癥狀，對(duì)慢性肝炎具有治療作用，該作用與狗蟻草藥材主治慢性肝炎相一致。槲皮素的抗炎作用是其最核心最顯著的藥理作用之一[7]。本文以槲皮素為指標(biāo)性成分，探索其含量測(cè)定方法，為進(jìn)一步完善狗蟻草藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；JN-52000DTS型超聲波清洗儀(寧波江南儀器廠)；FA2204B型電子天平(上海精密儀器儀表有限公司)。

A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；1.槲皮素圖1 狗蟻草HPLC色譜圖

1.2 材料 甲醇、乙腈、冰醋酸均為色譜純，水為重蒸水(實(shí)驗(yàn)室自制)，其他試劑均為分析純。槲皮素對(duì)照品(批號(hào)：100081-201408，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；狗蟻草3批樣品采自廣西南寧市郊，經(jīng)廣西藥用植物園藍(lán)鳴生教授鑒定為豆科植物狗蟻草Alysicarpusvagnalis(Linn. )DC。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取槲皮素對(duì)照品適量，置于10 mL容量瓶中，加適量甲醇，超聲溶解，再加甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾，制成每1 mL含槲皮素1.25 g的對(duì)照品溶液(1.25 g/mL)。

2.1.2 供試品溶液 取狗蟻草根粗粉約10 g，精密稱定，加10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并提取液，減壓回收乙醇至無(wú)醇味，殘?jiān)眠m量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾，即得供試品溶液。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Prevail ODS-C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-1%乙酸(B)；梯度洗脫：0～15 min，5%A；15～20 min，15%A；20～30 min，25%A；30～40 min，65%A；檢測(cè)波長(zhǎng)：365 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃。在此條件下，分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。色譜圖如圖1所示。

2.2.2 線性關(guān)系考察 依次精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.0 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾。分別吸取上述對(duì)照品溶液10 μL，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=364866X+109.58(R2=0.9996)，如圖2所示，表明進(jìn)樣量在0.125～1.25 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線效果圖

2.2.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果槲皮素峰面積的RSD值為1.72%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下的供試品溶液，分別于0、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果槲皮素峰面積的RSD值為0.94%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批南寧產(chǎn)狗蟻草藥材6份，按照“2.1.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定槲皮素含量。結(jié)果槲皮素含量的RSD值為1.12%(n=6)，表明重復(fù)性良好。

2.2.6 加樣回收試驗(yàn) 取已知槲皮素含量(1.0236 mg/g)的同一批南寧產(chǎn)狗蟻草藥材干品9份，每份約5 g，精密稱定，分別按100%的水平加入槲皮素對(duì)照品，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定槲皮素的含量，計(jì)算回收率。回收率(%)=[實(shí)測(cè)值(mg)-樣品含量(mg)]/對(duì)照品加入量(mg)×100%。結(jié)果平均回收率為99.3%，RSD值為1.06%(n=9)，表明回收率良好。詳見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果表 (n=9)

2.2.7 樣品測(cè)定 取3批狗蟻草藥材，每批3份。每份取約10 g，粉碎成粗粉(過(guò)40目篩)，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品中槲皮素的含量。結(jié)果見表2。

表2 不同批次狗蟻草槲皮素含量測(cè)定表 (n=3)

3 討論

3.1 含量測(cè)定指標(biāo)成分的選擇 根據(jù)中藥及其制劑分析中含量測(cè)定指標(biāo)成分的選擇原則，含量測(cè)定指標(biāo)成分應(yīng)確保藥材及其制劑的有效性、安全性和專屬性，研究首選有效成分作為含量測(cè)定指標(biāo)成分[8]。以本研究[6]為例，槲皮素具有抗炎活性，是狗蟻草藥材發(fā)揮治療作用的有效成分，同時(shí)也是該藥材主治功能的重要體現(xiàn)，故選擇槲皮素作為含量測(cè)定指標(biāo)成分。

3.2 流動(dòng)相的選擇 在參考文獻(xiàn)[9-11]的基礎(chǔ)上，對(duì)比分析了①甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶8∶1)、②乙腈-0.4%磷酸溶液(30∶70)、③甲醇-0.4%磷酸溶液(47∶53)3種溶劑系統(tǒng)，最終確定乙腈-1%乙酸為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，槲皮素的分離度大于1.5，色譜圖峰形較理想。

狗蟻草是廣西壯族民間常用草藥，其乙醇提取物具有抗腫瘤、抑菌、抗氧化等多種藥理活性，具有較好的開發(fā)應(yīng)用前景[12-14]。目前，狗蟻草化學(xué)成分研究較為欠缺，分離鑒定的化合物不足20個(gè)，且藥理作用研究對(duì)象均為提取物，具體是何種成分在起作用尚未明確，還有待進(jìn)一步研究。