肝內膽管結石的細菌學病因研究進展

徐西壯，夏曉華，劉瑞文

昆山市第一人民醫院，江蘇 蘇州 215300

原發性肝內膽管結石（primary intrahepatic lithiasis，PIL）在我國的發病率高達1.16%[1]。西方國家90%～95%的膽結石形成于膽囊，PIL占比較少，我國約25%的結石位于肝膽管內[2-3]。PIL主要成分為膽紅素鈣，屬于棕色色素型結石，因其疾病特點復雜多樣，治療困難，復發率高，部分患者常需要反復多次的手術，因而帶來巨大的經濟及心理負擔。PIL的形成是一個復雜且連續的過程，包括膽道的感染、慢性膽管炎、膽道狹窄、結石形成[4]。細菌在PIL的形成及復發中起著重要作用，從細菌學的角度來探討PIL形成的病因及發病機制，可豐富臨床的治療方法，對臨床的PIL防治具有指導意義。目前關于PIL的病因學研究較多，本文結合國內外最新研究文獻對PIL形成的細菌學機理進行綜述。

1 PIL的菌群失衡

1.1 PIL的細菌種類

過去數十年以來人們對于胃腸道內的微生物進行了廣泛研究，但對健康肝臟及膽管的人類膽汁微生物群的相關研究較少。Jiménez等[5]通過對健康豬的膽道菌群進行特征分析發現，健康母豬膽汁及膽道組織可檢出微生物群落，其中放線菌門（Actinobacteria）（32%）、變形菌門（Proteobacteria）（32%）、厚壁菌門（Phylum firmicutes）（34%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（2%）占比較高。這一發現打破了人們對于膽汁內無菌的固有認識。目前多種微生物在PIL患者的膽汁、結石、膽道組織中均有不同程度的檢出，它們以某種機制促進PIL的形成。有研究在PIL患者及動物模型的實驗中均檢測到幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）的存在[6-7]，且單純或同時感染至少一種尿素酶陽性的H.pylori，這是導致膽固醇性結石形成的必要條件；而且，感染細菌種類越多，結石患病率越高。Xiao等[8]通過對40例PIL患者與10例對照者的膽汁樣本研究發現，PIL患者菌群多樣性較高，其中腸球菌（Enterococcus）（33.77%）與腸桿菌（Enterobacteriaceae）（12.65%）占比較多。Sheen-Chen等[9]等針對150例PIL患者的膽汁進行化驗，結果顯示需氧菌占比約90%，遠高于厭氧菌，革蘭氏陰性菌檢出較多，為革蘭氏陽性菌的兩倍。2022年，黃超偉等[10]通過對428例PIL患者的膽汁分析，同樣發現革蘭氏陰性菌較多，其中主要為大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）（32.92%）和克雷伯氏菌（Klebsiella）（15.66%），革蘭氏陽性菌的主要為腸球菌（28.83%）。更有許多國內外研究同樣發現，除上述細菌外，銅綠假單胞菌（Pseudomonas sp）、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）、摩根氏菌（Morganella morganii）、弗氏檸檬酸桿菌屬（Citrobacter freundii）等均有不同程度的檢出[11-14]。現將國內外報道的細菌檢出情況匯總，見表1。

表1 國內外報道的PIL細菌檢出情況匯總

1.2 PIL的細菌檢測方法

傳統的細菌檢測方法多以細菌培養為主，該方法比較耗時且受外部環境影響較大。目前細菌檢測逐漸采用最新組學技術結合計算機的深度分析，通過提取整個細菌樣本中的DNA，以宏基因組二代測序技術（next-generation sequencing，NGS）檢測微生物的遺傳物質[15]。NGS作為一種高通量測序方法可以進行染色體計數并對基因表達譜進行分析[16]。利用NGS技術進行測序研究細菌菌落的結構和組成逐步成為重要檢測方式，16S rRNA及16S rDNA基因測序即采用了此技術[17]。16S rRNA基因長度相對較短（約1 542 bp），結構穩定，在大樣本量下也容易進行測序，是目前進行微生物鑒定的首選方法，提高了研究效率，也極大地促進了PIL的細菌學研究[18]。

2 PIL形成的細菌學病因

2.1 細菌在膽管內的定植與致石

E.coli等細菌之所以能在膽管內定植，很大程度上依賴自身存在的膽汁酸（bile acids，BAs）耐受性[19-20]，這種耐受性可以保護細菌的細胞質和DNA可以免受BAs的破壞。不同細菌在膽管內的定植可能導致膽固醇的過飽和，使“膽鹽-磷脂-膽固醇”平衡被打破，促進PIL的形成。Molinero等[21]研究發現，BAs的耐受性是此類細菌生存的必備能力，這種耐受性的產生依賴于微生物自身的膽汁流出系統和膽汁酸鹽水解酶（bile-salt hydrolases，BSHs）的作用。膽汁流出系統通過外排泵將累積在細胞質中的BAs和膽鹽擠壓至體外；BSHs可自由出入細胞，屬弱酸性，可以通過催化某種反應，捕獲并運輸質子，調節膽汁環境的pH值，維持細胞內環境穩定。

正常膽管內的定植菌數量極其有限，未達到致病條件，這是由于膽汁的沖刷、肝細胞之間的緊密連接、膽鹽對細菌增殖的抑制，以及Oddi括約肌的屏障作用[22]。當這些自身保護機制被破壞時，細菌即會通過各種途徑進入膽道，使膽道內的微環境發生改變[23]，比如，十二指腸內細菌經乳頭反流至膽總管，腸道內細菌經門靜脈系統進入肝內膽管，感染的膽囊將細菌輸送至膽總管，細菌經周圍淋巴系統侵入肝臟。這些因素進一步導致膽管菌群失衡，使膽管內細菌快速生長繁殖，引起膽道急性或慢性炎癥，出現膽管壁變性、滲出、增生、炎細胞浸潤等改變，甚至還可以引起膽管組織纖維化、膽管重塑、狹窄、變形，這些改變進一步加重了膽汁的排泄負擔，出現膽汁淤積，最終導致PIL的形成。

2.2 β-葡萄糖醛酸酶的作用

有研究表明，膽管細菌感染在PIL形成過程中起著重要作用[24]。在膽色素性結石患者的膽汁中發現存在產生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase，β-G）、膽汁酸水解酶及磷脂酶的細菌。此類細菌多帶負電荷，易與帶正電荷的鈣離子吸附，并在膽道內形成棕櫚酸鈣。這些細菌所產生的β-G等酶會改變膽汁的理化特性，進一步促進膽色素性結石的生成[25]。此外，低蛋白飲食可導致β-G的抑制劑葡聚糖-1，4內脂水平降低，引起β-G水平變化，同樣會導致PIL形成。

革蘭氏陰性菌分泌的內毒素，又稱脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），在PIL的形成及復發中起著重要作用[26]。這些細菌通過toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）的作用，利用LPS誘導釋放多種促炎癥及纖維化因子，包括COX-2、MCP-1、IL-6、VEGF、TNF-a、TGF-β1，通過PKC/NF-κ/C-myc途徑誘導內源性β-G的增加，導致PIL的形成及復發[27]。革蘭氏陰性菌尤其是E.coli通過分泌外源性的β-G刺激膽管分泌內源性β-G，而β-G又可催化膽紅素鈣的形成，最終導致PIL[4]。有研究表明，細菌感染和膽管梗阻也是內源性β-G活性增高的重要因素，當感染膽汁排空時，外源性β-G迅速下降，而內源性β-G可維持較高水平[28]。這種高水平的內源性β-G在色素性結石的形成中起著重要作用。

2.3 腸道細菌紊亂對膽汁成分的影響

Pedersen等[29]研究發現，高脂飲食可能促進厚壁菌門與擬桿菌門在腸管內的生長，然后進一步通過某種途徑進入膽道。針對入侵膽道的腸道細菌，膽汁具有一定的抗菌特性，這種特性主要依賴于BAs發揮作用。BAs具有兩親性，通過結合和溶解膜脂以裂解細菌[30]。BAs進入細菌細胞質后促進并引發細胞毒性機制，使細胞內部酸化，再由牛磺酸結合的膽鹽裂解產生有毒化合物如硫化氫，進一步造成DNA損傷。初級BAs比次級BAs毒性更大，而部分腸道細菌可以使初級BAs向次級BAs轉化，表達BSHs和膽汁酸誘導（bile acid-inducible，BAI）酶，可修飾并影響BAs的功能及信號特性，使其免受膽汁的溶解[22]。BAs又是法尼醇X受體（farnesoid X receptor，FXR）的內源性配體，FXR可通過調控相關的細胞因子及受體參與BAs的代謝[31]。肝內BAs升高時，BAs可激活BAs-FXR-小異源二聚體伴侶信號通路，抑制CYP7A1及CYP7B1基因的表達，從而降低BAs在肝內的合成。當出現腸道菌群紊亂，BSH活性增強，促進FXR合成，使得BAs的合成減少、膽固醇的過飽和，這一系列反應打破了“膽鹽-磷脂-膽固醇”的平衡性，導致結石的形成。另有研究發現，由腸道細菌代謝產生的氧化三甲胺（trimethylamine-N-oxide，TMAO）是三甲胺（trimethylamine，TMA）的代謝產物，并經腸上皮細胞吸收入血，隨后被黃素單加氧酶（flavin containing monooxygenases，FMOs）在肝臟氧化，血漿內高水平TMAO與PIL的形成呈現正相關性[32]。

3 PIL的分子生物學機制

3.1 細胞因子

膽管細胞是一種上皮細胞，主要排列在肝內和肝外的膽管樹，其主要的功能是通過多種信號通路控制膽汁的分泌。當出現細菌感染時，膽管細胞發生凋亡、溶解、修復和增殖等病理改變。Cheung等[33]研究發現，當感染導致膽管壁損傷時，正常的膽管分泌功能細胞可被激活，激活后的膽管細胞可增強分泌炎細胞因子和生長因子（包括IL-6、IL-8、TNF-α、血小板源性生長因子、內皮素-1、TGF-β和一氧化氮等）。這些因子而聚集免疫細胞和間充質細胞，增強局部損傷，促進膽道重塑[34]。損傷后的膽管細胞凋亡后開始激活增殖，如果細胞持續損傷，膽管細胞便會處于永久性的細胞周期阻滯和抗凋亡狀態，最終導致膽管細胞組織功能障礙，進一步促使膽管壁狹窄變性，膽汁淤積[35]。而膽汁淤積是PIL形成的重要因素[36]，過多BAs的聚集引起膽管壁損傷，再次導致膽管細胞大量分泌細胞因子，形成惡性循環。

3.2 基因與編碼蛋白

目前研究較多的致石基因包括CFTR、ABCB4、ABCB11等，它們均以某種機制促進膽汁成分改變和膽道纖維化，促使PIL的形成，而細菌又在某些過程中起著重要作用。在膽管上皮細胞膜表面存在著多種特異性表達分布的轉運體和調控蛋白，共同參與并促進肝細胞的膽汁排泄。其中囊性纖維化跨膜轉導調節因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）蛋白的異常，可以使膽汁黏稠度增加，導致膽汁淤積[37]。梅璇等[38]通過對104 例PIL患者與同期120 例健康者的CFTR基因測序發現，兩組M470V位點上的等位基因存在差異（χ2=15.139，P＜0.01），且M470V位點上等位基因G頻率明顯高于對照組（60.10%vs41.67%，P＜0.01）。Reichert等[39]通過小鼠實驗，重復回交將抗纖維化的FVB/NJ菌株的ABCB4基因片段敲除轉移到易纖維化BALB/cJ菌株，然后將這兩個同源的敲除菌株雜交，產生的F2后代都是ABCB4基因缺陷的；在16周齡時，F2小鼠均出現不同程度的膽道纖維化。Lammert等[40]同樣研究發現，敲除ABCB4基因的小鼠膽汁與膽固醇過飽和，最終導致PIL的形成。Gan等[41]通過外顯子測序方法對443例PIL患者和560例健康對照者進行研究，發現ABCB11基因突變，可通過外顯子跳躍改變基因剪接，從而影響成熟mRNA表達；而且，突變體中BSEP蛋白的轉運功能下降，導致BSEP膽汁轉運減少，進而影響膽汁成分，導致PIL。

4 小結與展望

綜上所述，PIL的形成是一個復雜且連續的過程，不同菌群通過影響某一個或多個環節，參與PIL的形成。PIL的形成一般伴有膽汁成分改變和膽管的慢性纖維化改變，這使PIL的治療難度進一步增大。通過研究PIL形成的相關細菌學原理，有助于指導臨床上PIL的預防及治療。目前來看PIL的治療不單是去除結石，外科手術后防治感染并且維持膽管、腸道內菌群的穩定也是至關重要。此外，關于國內外PIL的細菌學病因的研究成果較多，但具體機制尚未達成共識，利用這些成果在臨床上對應的治療方法尚處于探索階段，還需進行更高質量的隨機對照研究，為PIL的防治提供新的理論依據。