四川發現云開脊蛇

張佳琦 ，李科，王朝英，吳亞勇，舒國成 ，時磊

（1. 新疆農業大學，烏魯木齊 830052；2. 宜賓學院，四川宜賓 644007）

脊 蛇屬AchalinusPeters，1869，是閃 皮蛇 科Xenodermidae 物種數量最為豐富的類群，目前已描述物種22 種，其中我國記錄有16 種（Peters，1869；趙爾宓，2006；Liet al.，2021；Yanget al.，2022）。近些年，隨著分子技術的發展，脊蛇屬物種多樣性得到了更深入的研究，但多數物種的研究僅基于個別采樣地或少數個體，大多數物種的具體分布區及種下關系并不明晰（Wanget al.，2019；Houet al.，2021；Liet al.，2021；Yanget al.，2022），如近年新發表 的云 開脊 蛇A. yunkaiensisWang，Li & Wang，2019、越北脊蛇A. emilyaeZiegler，Nguyen，Pham，Nguyen，Pham，Van Schingen，Nguyen & Le，2019（Van Phamet al.，2019）和楊氏脊蛇A. yangdatongiHou，Wang，Guo，Chen，Yuan & Che，2021的新分布區陸續被報道（喻敏等，2020；Houet al.，2021）。我國是脊蛇屬物種的主要分布區，其中四川省已記錄脊蛇屬物種3 種：黑脊蛇A. spinalisPeters，1869、美姑脊蛇A. meiguensisHu & Zhao，1966和攀枝花脊蛇A. panzhihuaensisHou，Wang，Guo，Chen，Yuan & Che，2021（趙爾宓，2006；Houet al.，2021）。

2022年6月，在四川省瀘州市畫稿溪國家級自然保護區開展動物學野外實習期間采集到2 號蛇類標本，通過形態學比較和分子遺傳關系分析，確定為云開脊蛇，系四川省蛇類分布新記錄種。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

共采集到1號雌性亞成體標本（YBU 22050）和1號雄性幼體標本（YBU 22148）。在拍攝完照片后經安樂死取得肝臟等組織，組織置于95%乙醇溶液，后轉存于-80 ℃超低溫冰箱；標本先經10%甲醛溶液處理，待標本定型后保存于80%乙醇溶液。所有組織及標本均保存于宜賓學院（YBU）的動物多樣性與生態保育宜賓市重點實驗室。

1.2 形態鑒定

形態測量及描述依據趙爾宓等（1998）、趙爾宓（2006）、Wang等（2019）、Li K等（2020，2021）和喻敏等（2020）。包括長度測量、鱗片計數及色斑描述。使用軟尺測量尾長（tail length，TaL）、頭體長（snout-vent length，SVL）和總長（total length，TL）（精度1 mm）；利用數顯游標卡尺測量鱗片長度：前額鱗溝（length of suture between the prefrontals，LSBP）和鼻間鱗溝（length of suture between internasals，LSBI）、頰鱗的長度（length of loreal，LeL）、頰鱗的高度（high of loreal，HiL）、前1枚鼻鱗的長度（length of anterior section of nasal，LaSN）和后1 枚鼻鱗的長度（length of posterior section of nasal，LpSN）（精度0.01 mm）。借助體式顯微鏡［舜宇ESDPTOP SZN71，舜宇光學科技（集團）有限公司］計數鱗片，若是對稱性鱗片，則對左右兩側分別計數。計數形態特征包括背鱗（dorsal scale rows，DSR）、上頜齒（maxillary teeth counts，MT）、鼻鱗（nasals，NS）、頰鱗（loreals，LR）、上唇鱗（supralabials，SPL）、下唇鱗（infralabials，IFL）、顳鱗（temporals，TMP）、前顳鱗（anterior temporals，aTMP）、中顳鱗（middle temporals，mTMP）、后顳鱗（posterior temporals，pTMP）、腹鱗（ventral scales，V）、頷片（chin-shields，CS）、眶上鱗（supraocular，SpO）、眶前鱗（preoculars，PrO）、眶后鱗（postoculars，PtO）、頦鱗（mentals，PM）和尾下鱗（subcaudals，SC）。

1.3 分子鑒定

使用TIANGEN 試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取肝組織基因組總DNA，線粒體COⅠ基因擴增引物Chmf4/Chmr4（Cheet al.，2012）。用Lasergene 7.1（DNASTAR）的SeqMan 對所獲得的序列進行拼接。從GenBank 下載已發表的脊蛇屬物種的COⅠ序列，選取老撾擬須唇蛇Parafimbrios laoTeynié，David，Lottier，Le，Vidal & Nguyen，2015（Teyniéet al.，2015）、越南擬須唇蛇P. vietnamensisZiegler，Ngo，Pham，Nguyen，Le & Nguyen，2018（Ziegleret al.，2018）、克 氏須唇 蛇Fimbrios klossiSmith，1921（Schizaset al.，2015）和爪哇閃皮蛇Xenodermus javanicusReinhardt，1836（Rovatsoset al.，2016）為外群（附表1）。利用MEGA 7.0 的Clustal W 算法對獲得的所有序列進行比對（Kumaret al.，2016），人工校正。利用PartitionFinder 2.1.1選擇數據集最適模型（Lanfearet al.，2017），最終在MrBayes 3.2.4（Ronquistet al.，2012）和Raxml-GUI 1.3（Silvestro & Michalak，2012）中分別構建貝葉斯樹和最大似然樹。

表1 基于COⅠ基因的不同產地云開脊蛇個體間的遺傳距離Table 1 Genetic distance between snakes from different regions based on COⅠ gene

附表1 樣本序列信息Appendix 1 Information for COI gene sequences used in this study

利用MEGA 7.0（Kumaret al.，2016）中的未校正距離模型估算物種間的遺傳距離。

2 結果

2.1 形態鑒定與描述

采自畫稿溪國家級自然保護區的1 號雌性亞成體（圖1）和1 號雄性幼體，其特征表現為眶前鱗和眶后鱗常缺失、尾下鱗不成對等特征，初步鑒定為脊蛇屬物種。其具體形態如下：（1）通身背鱗23 行，除最外行外均起棱明顯且具有自前向后增強趨，最外行背鱗顯著擴大；（2）上頜齒數24枚，靠近吻端略小，后端幾乎等大且排列不均勻；（3）鼻間鱗2枚，前額鱗2枚；（4）額鱗1枚，未入眶；（5）頜片2對，與腹鱗相切，其間無小鱗，后頜片略長于前頜片；（6）頂鱗1對，與正前方額鱗相切；（7）鼻鱗二分，前大后小；（8）頰鱗1 枚，扁長，長約2 倍于高；（9）顳鱗3列，2+2+3式，第一列全入眶；（10）上唇鱗6 對，第4～5 枚入眶；（11）下唇鱗5～6 對，第1 對在頦鱗末端相切，左右前3 枚與前頷片相切；（12）肛鱗完整；（13）背面呈棕黑色，略具金屬光澤，腹面乳白色；（14）脊線不明顯，從頂鱗后方發出向后延伸至尾端（圖2）。其中，雌性個體TaL/TL 百分比為24.2%，LSBP＞LSBI（17.7 mm vs. 11.6 mm），下唇鱗6 枚，腹鱗145 枚（加2 枚前腹鱗），尾下鱗65 枚；雄 性 幼 體TaL/TL 為24.5%，LSBP＞LSBI（9.7 mm vs. 8.6 mm），下 唇 鱗5 枚，腹 鱗146 枚（加2 枚前腹鱗），尾下鱗64 枚。形態上，該2 號標本與云開脊蛇鑒別特征較為一致（附表2）。經形態鑒定，此次采集的蛇類標本為云開脊蛇。

圖1 四川畫稿溪國家自然保護區采集的云開脊蛇（標本號：YBU 22050；李科 攝）Fig. 1 Achalinus yunkaiensis from the Huagaoxi National Nature Reserve，Sichuan（voucher No.：YBU 22050；photoed by Li Ke）

圖2 四川畫稿溪云開脊蛇（標本號：YBU 22050）的形態特征（李科 攝）Fig. 2 Morphological characteristics of Achalinus yunkaiensis （voucher No.：YBU 22050）from the Huagaoxi National Nature Reserve，Sichuan （photoed by Li Ke）

附表2 不同產地的云開脊蛇特征比較Appendix 2 Comparison of the characteristics of Achalinus yunkaiensis from different regions

2.2 系統發育關系

由于雄性幼體較小，為保證標本的完整性未采集分子樣，只采用1 號雌性樣本構建系統發育樹。經MEGA 7.0 比對剪切后獲得654 bp 的COⅠ基因片段（GenBank登錄號：OR344062）。基于PartitionFinder v2.1.1 對數據集進行密碼子分區選取的最適模型分別為K80+I+G（第1 密碼子），TIM+I（第2 密碼子）和TIM+G（第3 密碼子）；構建的貝葉斯樹和最大似然樹的拓撲結構基本一致（圖3）。結果顯示所有脊蛇屬物種聚為一個高支持率的分支（PP=1.00，BS=100），明確了脊蛇屬內部分物種間關系；此次采集的標本與云開脊蛇聚為一支，該支系與黑脊蛇、阿里山脊蛇A. nigerMaki，1931 和臺灣脊蛇A. formosanusBoulenger，1908 又形成單系。四川個體與云開脊蛇其他個體間遺傳距離為3.1%～3.3%（表1），該遺傳分化普遍小于脊蛇屬屬內物種間遺傳距離（≥3.4%；Yanget al.，2022）。

圖3 基于線粒體COⅠ基因構建的脊蛇屬系統發育樹（左：貝葉斯樹；右：最大似然樹）Fig. 3 Phylogenetic tree of Achalinus based on mitochondrial COⅠ gene（left：Bayesian phylogenetic tree；right：Maximum Likelihood tree）

結合形態學比較和系統發育分析，確定此次采集的蛇類標本YBU 22050 和YBU 22148 為云開脊蛇，系四川省蛇類新分布記錄種。

3 討論

云開脊蛇首先發現于我國廣東省云開山大霧嶺地區（Wanget al.，2019），喻敏等（2020）報道了該物種在廣西貓兒山的新分布記錄。廣東的樣本采集于4月、6月和8月，廣西的樣本采集于8月，四川樣本則采集于6 月。與四川相比，廣東緯度更低，4 月氣溫可能就已達到適合該蛇活動的溫度。并且此次發現的2 條云開脊蛇均采集于四川瀘州畫稿溪國家級自然保護區內的一處竹林與公路相接的淺草叢中（圖4），該采集地位于四川東南部，地接云貴高原，為典型的丹霞地貌景觀，植被類型以常綠闊葉林為主，與以前采集地植被類型相同、生境相似，同時具有豐富的其他同域物種分布。

圖4 四川畫稿溪國家級自然保護區云開脊蛇棲息生境（王朝英 攝）Fig. 4 Habitat of Achalinus yunkaiensis in the Huagaoxi National Nature Reserve，Sichuan（photoed by Wang Chaoying）

在形態上，四川的雌性個體在體全長（306 mm vs. 339 mm）、尾長（74 mm vs. 53 mm）、腹鱗（145 枚vs. 153枚）和尾下鱗（65枚 vs. 51枚）與廣西雌性個體存在一定差異；同時，四川雄性個體TaL/TL 大于廣東雄性個體（24.5% vs. 18.5%～20.0%），尾下鱗也多于廣東個體（64 枚 vs. 49～56 枚），但腹鱗少于廣東個體（146枚 vs. 151～162枚），且廣東個體的前額鱗溝與鼻間鱗溝相等，而四川個體和廣西個體的前額鱗溝均長于鼻間鱗溝，這說明云開脊蛇存在一定地理變異，這是否源于遺傳差異或標本量不足仍有待進一步增加標本量核實。

云開脊蛇最大種下遺傳距離達到3.3%，該結果與Yang等（2022）認為的脊蛇屬最小種間遺傳距離（3.4%）較為接近。脊蛇屬物種屬于古老的中小型穴居蛇類，活動能力十分受限，斑塊化的生境極易導致各地理種群間產生隔離，從而產生遺傳和外部形態上的分化，當前，有關脊蛇屬的研究仍然十分缺乏，各物種的有效性還應結合更多的種群及樣本進行評估。本研究擴展了云開脊蛇在我國的地理分布，豐富了四川蛇類的物種多樣性，同時揭示云開脊蛇可能存在一定的地理變異，這為脊蛇屬的種間關系研究提供了一定參考。

致謝：感謝云南大學碩士研究生唐奎在標本采集中提供的幫助，感謝宜賓學院動物多樣性與生態保育宜賓市重點實驗室本科生李莉、蔣玉蓮在分子實驗中的幫助。