四川發(fā)現(xiàn)云開脊蛇

張佳琦 ，李科，王朝英，吳亞勇，舒國成 ，時磊

（1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，烏魯木齊 830052；2. 宜賓學(xué)院，四川宜賓 644007）

脊 蛇屬AchalinusPeters，1869，是閃 皮蛇 科Xenodermidae 物種數(shù)量最為豐富的類群，目前已描述物種22 種，其中我國記錄有16 種（Peters，1869；趙爾宓，2006；Liet al.，2021；Yanget al.，2022）。近些年，隨著分子技術(shù)的發(fā)展，脊蛇屬物種多樣性得到了更深入的研究，但多數(shù)物種的研究僅基于個別采樣地或少數(shù)個體，大多數(shù)物種的具體分布區(qū)及種下關(guān)系并不明晰（Wanget al.，2019；Houet al.，2021；Liet al.，2021；Yanget al.，2022），如近年新發(fā)表 的云 開脊 蛇A. yunkaiensisWang，Li & Wang，2019、越北脊蛇A. emilyaeZiegler，Nguyen，Pham，Nguyen，Pham，Van Schingen，Nguyen & Le，2019（Van Phamet al.，2019）和楊氏脊蛇A. yangdatongiHou，Wang，Guo，Chen，Yuan & Che，2021的新分布區(qū)陸續(xù)被報道（喻敏等，2020；Houet al.，2021）。我國是脊蛇屬物種的主要分布區(qū)，其中四川省已記錄脊蛇屬物種3 種：黑脊蛇A. spinalisPeters，1869、美姑脊蛇A. meiguensisHu & Zhao，1966和攀枝花脊蛇A. panzhihuaensisHou，Wang，Guo，Chen，Yuan & Che，2021（趙爾宓，2006；Houet al.，2021）。

2022年6月，在四川省瀘州市畫稿溪國家級自然保護區(qū)開展動物學(xué)野外實習(xí)期間采集到2 號蛇類標(biāo)本，通過形態(tài)學(xué)比較和分子遺傳關(guān)系分析，確定為云開脊蛇，系四川省蛇類分布新記錄種。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

共采集到1號雌性亞成體標(biāo)本（YBU 22050）和1號雄性幼體標(biāo)本（YBU 22148）。在拍攝完照片后經(jīng)安樂死取得肝臟等組織，組織置于95%乙醇溶液，后轉(zhuǎn)存于-80 ℃超低溫冰箱；標(biāo)本先經(jīng)10%甲醛溶液處理，待標(biāo)本定型后保存于80%乙醇溶液。所有組織及標(biāo)本均保存于宜賓學(xué)院（YBU）的動物多樣性與生態(tài)保育宜賓市重點實驗室。

1.2 形態(tài)鑒定

形態(tài)測量及描述依據(jù)趙爾宓等（1998）、趙爾宓（2006）、Wang等（2019）、Li K等（2020，2021）和喻敏等（2020）。包括長度測量、鱗片計數(shù)及色斑描述。使用軟尺測量尾長（tail length，TaL）、頭體長（snout-vent length，SVL）和總長（total length，TL）（精度1 mm）；利用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測量鱗片長度：前額鱗溝（length of suture between the prefrontals，LSBP）和鼻間鱗溝（length of suture between internasals，LSBI）、頰鱗的長度（length of loreal，LeL）、頰鱗的高度（high of loreal，HiL）、前1枚鼻鱗的長度（length of anterior section of nasal，LaSN）和后1 枚鼻鱗的長度（length of posterior section of nasal，LpSN）（精度0.01 mm）。借助體式顯微鏡［舜宇ESDPTOP SZN71，舜宇光學(xué)科技（集團）有限公司］計數(shù)鱗片，若是對稱性鱗片，則對左右兩側(cè)分別計數(shù)。計數(shù)形態(tài)特征包括背鱗（dorsal scale rows，DSR）、上頜齒（maxillary teeth counts，MT）、鼻鱗（nasals，NS）、頰鱗（loreals，LR）、上唇鱗（supralabials，SPL）、下唇鱗（infralabials，IFL）、顳鱗（temporals，TMP）、前顳鱗（anterior temporals，aTMP）、中顳鱗（middle temporals，mTMP）、后顳鱗（posterior temporals，pTMP）、腹鱗（ventral scales，V）、頷片（chin-shields，CS）、眶上鱗（supraocular，SpO）、眶前鱗（preoculars，PrO）、眶后鱗（postoculars，PtO）、頦鱗（mentals，PM）和尾下鱗（subcaudals，SC）。

1.3 分子鑒定

使用TIANGEN 試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取肝組織基因組總DNA，線粒體COⅠ基因擴增引物Chmf4/Chmr4（Cheet al.，2012）。用Lasergene 7.1（DNASTAR）的SeqMan 對所獲得的序列進行拼接。從GenBank 下載已發(fā)表的脊蛇屬物種的COⅠ序列，選取老撾擬須唇蛇Parafimbrios laoTeynié，David，Lottier，Le，Vidal & Nguyen，2015（Teyniéet al.，2015）、越南擬須唇蛇P. vietnamensisZiegler，Ngo，Pham，Nguyen，Le & Nguyen，2018（Ziegleret al.，2018）、克 氏須唇 蛇Fimbrios klossiSmith，1921（Schizaset al.，2015）和爪哇閃皮蛇Xenodermus javanicusReinhardt，1836（Rovatsoset al.，2016）為外群（附表1）。利用MEGA 7.0 的Clustal W 算法對獲得的所有序列進行比對（Kumaret al.，2016），人工校正。利用PartitionFinder 2.1.1選擇數(shù)據(jù)集最適模型（Lanfearet al.，2017），最終在MrBayes 3.2.4（Ronquistet al.，2012）和Raxml-GUI 1.3（Silvestro & Michalak，2012）中分別構(gòu)建貝葉斯樹和最大似然樹。

表1 基于COⅠ基因的不同產(chǎn)地云開脊蛇個體間的遺傳距離Table 1 Genetic distance between snakes from different regions based on COⅠ gene

附表1 樣本序列信息Appendix 1 Information for COI gene sequences used in this study

利用MEGA 7.0（Kumaret al.，2016）中的未校正距離模型估算物種間的遺傳距離。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)鑒定與描述

采自畫稿溪國家級自然保護區(qū)的1 號雌性亞成體（圖1）和1 號雄性幼體，其特征表現(xiàn)為眶前鱗和眶后鱗常缺失、尾下鱗不成對等特征，初步鑒定為脊蛇屬物種。其具體形態(tài)如下：（1）通身背鱗23 行，除最外行外均起棱明顯且具有自前向后增強趨，最外行背鱗顯著擴大；（2）上頜齒數(shù)24枚，靠近吻端略小，后端幾乎等大且排列不均勻；（3）鼻間鱗2枚，前額鱗2枚；（4）額鱗1枚，未入眶；（5）頜片2對，與腹鱗相切，其間無小鱗，后頜片略長于前頜片；（6）頂鱗1對，與正前方額鱗相切；（7）鼻鱗二分，前大后小；（8）頰鱗1 枚，扁長，長約2 倍于高；（9）顳鱗3列，2+2+3式，第一列全入眶；（10）上唇鱗6 對，第4～5 枚入眶；（11）下唇鱗5～6 對，第1 對在頦鱗末端相切，左右前3 枚與前頷片相切；（12）肛鱗完整；（13）背面呈棕黑色，略具金屬光澤，腹面乳白色；（14）脊線不明顯，從頂鱗后方發(fā)出向后延伸至尾端（圖2）。其中，雌性個體TaL/TL 百分比為24.2%，LSBP＞LSBI（17.7 mm vs. 11.6 mm），下唇鱗6 枚，腹鱗145 枚（加2 枚前腹鱗），尾下鱗65 枚；雄 性 幼 體TaL/TL 為24.5%，LSBP＞LSBI（9.7 mm vs. 8.6 mm），下 唇 鱗5 枚，腹 鱗146 枚（加2 枚前腹鱗），尾下鱗64 枚。形態(tài)上，該2 號標(biāo)本與云開脊蛇鑒別特征較為一致（附表2）。經(jīng)形態(tài)鑒定，此次采集的蛇類標(biāo)本為云開脊蛇。

圖1 四川畫稿溪國家自然保護區(qū)采集的云開脊蛇（標(biāo)本號：YBU 22050；李科 攝）Fig. 1 Achalinus yunkaiensis from the Huagaoxi National Nature Reserve，Sichuan（voucher No.：YBU 22050；photoed by Li Ke）

圖2 四川畫稿溪云開脊蛇（標(biāo)本號：YBU 22050）的形態(tài)特征（李科 攝）Fig. 2 Morphological characteristics of Achalinus yunkaiensis （voucher No.：YBU 22050）from the Huagaoxi National Nature Reserve，Sichuan （photoed by Li Ke）

附表2 不同產(chǎn)地的云開脊蛇特征比較Appendix 2 Comparison of the characteristics of Achalinus yunkaiensis from different regions

2.2 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

由于雄性幼體較小，為保證標(biāo)本的完整性未采集分子樣，只采用1 號雌性樣本構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。經(jīng)MEGA 7.0 比對剪切后獲得654 bp 的COⅠ基因片段（GenBank登錄號：OR344062）?；赑artitionFinder v2.1.1 對數(shù)據(jù)集進行密碼子分區(qū)選取的最適模型分別為K80+I+G（第1 密碼子），TIM+I（第2 密碼子）和TIM+G（第3 密碼子）；構(gòu)建的貝葉斯樹和最大似然樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致（圖3）。結(jié)果顯示所有脊蛇屬物種聚為一個高支持率的分支（PP=1.00，BS=100），明確了脊蛇屬內(nèi)部分物種間關(guān)系；此次采集的標(biāo)本與云開脊蛇聚為一支，該支系與黑脊蛇、阿里山脊蛇A. nigerMaki，1931 和臺灣脊蛇A. formosanusBoulenger，1908 又形成單系。四川個體與云開脊蛇其他個體間遺傳距離為3.1%～3.3%（表1），該遺傳分化普遍小于脊蛇屬屬內(nèi)物種間遺傳距離（≥3.4%；Yanget al.，2022）。

圖3 基于線粒體COⅠ基因構(gòu)建的脊蛇屬系統(tǒng)發(fā)育樹（左：貝葉斯樹；右：最大似然樹）Fig. 3 Phylogenetic tree of Achalinus based on mitochondrial COⅠ gene（left：Bayesian phylogenetic tree；right：Maximum Likelihood tree）

結(jié)合形態(tài)學(xué)比較和系統(tǒng)發(fā)育分析，確定此次采集的蛇類標(biāo)本YBU 22050 和YBU 22148 為云開脊蛇，系四川省蛇類新分布記錄種。

3 討論

云開脊蛇首先發(fā)現(xiàn)于我國廣東省云開山大霧嶺地區(qū)（Wanget al.，2019），喻敏等（2020）報道了該物種在廣西貓兒山的新分布記錄。廣東的樣本采集于4月、6月和8月，廣西的樣本采集于8月，四川樣本則采集于6 月。與四川相比，廣東緯度更低，4 月氣溫可能就已達到適合該蛇活動的溫度。并且此次發(fā)現(xiàn)的2 條云開脊蛇均采集于四川瀘州畫稿溪國家級自然保護區(qū)內(nèi)的一處竹林與公路相接的淺草叢中（圖4），該采集地位于四川東南部，地接云貴高原，為典型的丹霞地貌景觀，植被類型以常綠闊葉林為主，與以前采集地植被類型相同、生境相似，同時具有豐富的其他同域物種分布。

圖4 四川畫稿溪國家級自然保護區(qū)云開脊蛇棲息生境（王朝英 攝）Fig. 4 Habitat of Achalinus yunkaiensis in the Huagaoxi National Nature Reserve，Sichuan（photoed by Wang Chaoying）

在形態(tài)上，四川的雌性個體在體全長（306 mm vs. 339 mm）、尾長（74 mm vs. 53 mm）、腹鱗（145 枚vs. 153枚）和尾下鱗（65枚 vs. 51枚）與廣西雌性個體存在一定差異；同時，四川雄性個體TaL/TL 大于廣東雄性個體（24.5% vs. 18.5%～20.0%），尾下鱗也多于廣東個體（64 枚 vs. 49～56 枚），但腹鱗少于廣東個體（146枚 vs. 151～162枚），且廣東個體的前額鱗溝與鼻間鱗溝相等，而四川個體和廣西個體的前額鱗溝均長于鼻間鱗溝，這說明云開脊蛇存在一定地理變異，這是否源于遺傳差異或標(biāo)本量不足仍有待進一步增加標(biāo)本量核實。

云開脊蛇最大種下遺傳距離達到3.3%，該結(jié)果與Yang等（2022）認(rèn)為的脊蛇屬最小種間遺傳距離（3.4%）較為接近。脊蛇屬物種屬于古老的中小型穴居蛇類，活動能力十分受限，斑塊化的生境極易導(dǎo)致各地理種群間產(chǎn)生隔離，從而產(chǎn)生遺傳和外部形態(tài)上的分化，當(dāng)前，有關(guān)脊蛇屬的研究仍然十分缺乏，各物種的有效性還應(yīng)結(jié)合更多的種群及樣本進行評估。本研究擴展了云開脊蛇在我國的地理分布，豐富了四川蛇類的物種多樣性，同時揭示云開脊蛇可能存在一定的地理變異，這為脊蛇屬的種間關(guān)系研究提供了一定參考。

致謝：感謝云南大學(xué)碩士研究生唐奎在標(biāo)本采集中提供的幫助，感謝宜賓學(xué)院動物多樣性與生態(tài)保育宜賓市重點實驗室本科生李莉、蔣玉蓮在分子實驗中的幫助。