腫瘤相關中性粒細胞的雙向調控作用及其在膀胱尿路上皮癌中的研究進展

鄧凱 楊萌 張琳 錢俊安 史云強 王春暉，2

1昆明醫科大學附屬延安醫院泌尿外科（昆明 650000）；2云南省腫瘤免疫防治研究重點實驗室（昆明 650000）

中性粒細胞在抵御微生物感染及創傷后的炎癥損傷過程中發揮重要作用［1-2］。但在腫瘤進展過程中，腫瘤相關中性粒細胞（tumor-associated neutrophils，TAN）被認為是一個“旁觀者”或“中立派”。而近年來的研究表明TAN 并不是真正的“中立”，相反，TAN 可以通過多種途徑抑制或促進腫瘤進展，這種雙向調控源于TAN 高度的異質性和可塑性。因其可塑性，TAN 在發育、分化、募集的過程中被誘導極化為許多異質性亞群，表現出不同的功能表型，即TAN 的可塑性和異質性是其發揮雙向調控作用的基礎。通過操縱TAN 在腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）中的浸潤水平或其功能表型，有望為目前的腫瘤治療帶來全新的靶點和思路，但由于其異質性，在討論TAN 的抑瘤或促瘤作用時，須考慮到具體的腫瘤類型甚至是臨床分期的不同。

1 TAN 的異質性和可塑性

TAN來源于骨髓，是人體內數量最多的免疫細胞，具有壽命短和更新快的特點，造血干細胞逐步發育分化為粒細胞-單核細胞祖細胞（granulocytemonocyte progenitors，GMPs）后，在G-CSF及GM-CSF的誘導下，逐步分化成熟。

TAN 發育成熟后大部分仍繼續留在骨髓，其釋放受到嚴格的調控。趨化因子受體CXCR4 和CXCR2 及其配體決定了TAN 進入血液循環的數量。其中，CXCR4與CXCL12促使TAN 繼續保留在骨髓，CXCR2、CXCL1、CXCL2 促使TAN 進入血液循環當中。G-CSF 通過誘導增加CXCL1、CXCL2或減少CXCL12、 CXCR4 的表達，促進TAN 進入循環，快速升高血液中粒細胞水平。腫瘤細胞也可分泌G-CSF，因此腫瘤患者循環中未成熟TAN 的比例較正常人明顯升高。TAN 與各組織的親和程度也不同，以上各種因素共同作用導致了TAN 在發育階段以及分布空間上的異質性。

目前關于TAN 亞群的分型尚無特異性的標記分子，常以TAN 亞群表現出的功能表型作為分型依據，將發揮抗腫瘤作用或炎性反應的TAN 稱為N1 型，將發揮促腫瘤作用的TAN 稱為N2 型。也可以根據分布位置，分為外周血TAN 和腫瘤浸潤性中性粒細胞（tumor infiltrating neutrophils，TIN）。根據發育程度的不同，可分為未成熟和成熟TAN［1-3］。

轉化生長因子（transforming growth factor-β，TGF-β）可以誘導TAN 向著N2 極化。經TGF-β 誘導后的TAN 主要為N2 型，而阻斷TGF-β 后，TME內CD8+T 細胞的數量和活性均增加，免疫治療的療效得到增強，TME 內的TAN 極化方向由N2 轉向了N1。IFN-β 可以誘導TAN 想著N1 的方向分化，比如在缺乏IFN-β 時，小鼠肺部腫瘤中以N2 為主，細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule 1，ICAM1）和TNF-α 表達低，而經過IFN-β 治療后TNF-α 及ICAM1 表達增加，T 細胞的活化增強，TAN 向著N1 極化，表現出抗腫瘤特性。

在同一類型腫瘤的不同分期中，TAN 的功能表型也可能存在不同，一般來說，在原發腫瘤早期，TAN 常常以N1 型為主，而隨著腫瘤的進展，TME中的TAN 逐漸轉變為以N2 為主，一定程度上代表了腫瘤進展的結果［4］。受限于傳統定義TAN 亞群的方法，光鏡下的細胞或細胞核形態差異并不能將異質性TAN 亞群很好的區分開，對TAN 異質性產生的原因更是知之甚少。雖然近年來有研究提出以組織學染色、電鏡分析以及分子表型等對TAN 進行更加準確合理的分型，但目前為止尚沒有任何一種方法能夠用來準確鑒別TAN 的異質性并解釋其產生原因。

2 TAN 的雙向調控

TAN 是TME 中存在的多種免疫細胞之一［5］，在腫瘤進展過程中發揮重要作用，但其具體是促癌還是抑癌，在不同的研究中得出的結果并不相同：一些研究結果顯示TAN 具有抗腫瘤潛力［6-7］，但另一些研究卻顯示TAN 具有促進腫瘤進展的特性。先前的研究發現，未成熟TAN 的異位出現可能是造成不同功能表型的原因，因為免疫抑制性TAN 通常具有更不成熟的表型，有人甚至將免疫抑制表型的TAN 等同于未成熟TAN，TAN 的成熟與否成為標記TAN 功能表型的重要依據。然而，并不是所有免疫異質性TAN 都是未成熟的，而未成熟的TAN 也不一定就是免疫抑制性的，如血液中免疫抑制性TAN 同樣包括已經發育成熟的細胞；CD1-CD66+的未成熟TAN 被證實可以活化T 細胞發揮抗腫瘤活性，而CD10+的成熟TAN 則具備相反的作用。也有人認為是粒細胞內獨特的顆粒組成引起了未成熟和成熟TAN 表型的差異。

2.1 抗腫瘤作用在胃癌、結直腸癌（Ⅲ期）和高級別卵巢癌的研究中，TAN 的浸潤程度與較好的預后相關，提示TAN 可能具有抗腫瘤潛能，這種抗腫瘤作用通過直接或間接的多種途徑實現［2］。

TAN 可以通過自身接觸和細胞毒性作用直接殺傷腫瘤細胞［7］，這種殺傷作用與局部缺氧相關而與T 細胞無關，緩解缺氧后，TME 內TAN 的募集減少，但有趣的是，在這種條件下募集的TAN 卻能夠更有效的殺傷腫瘤細胞［8］。G-CSF、趨化因子、脂多糖以及IFN-β 等多種刺激因素通過與TAN 細胞膜上的相應受體結合，以及轉化生長因子-β 受體（TGFβR）信號傳導的阻斷，可以促進H2O2的產生和釋放，導致瞬時受體電位陽離子通道M 亞家族成員2（transient receptor potential melastatin 2，TRPM2）的激活和開放，促使Ca2+大量流入，引起腫瘤細胞死亡［9］。肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）可通過作用于中性粒細胞上的HGF 受體（也稱為MET）促進誘導型一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，iNOS）的表達和NO 的釋放，對腫瘤細胞造成殺傷。TAN 還能通過抗體依賴的細胞毒性作用（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）殺傷腫瘤細胞［10］，并以機械性破壞的方式對腫瘤細胞膜進行攝取，造成腫瘤細胞的崩解死亡，該過程涉及信號調節蛋白-α（signal regulatory protein alpha，SIRPα）與CD47 的相互作用，表明靶向該通路具有潛在的治療應用價值［2，6］。在一項宮頸腺癌小鼠模型的研究中發現，TAN 還能分泌一種能降解基底膜成分的廣譜蛋白酶，促使腫瘤細胞從基底膜脫落，發揮抑制腫瘤的作用（圖1A-C）。

除了直接殺傷腫瘤細胞外，TAN 分泌的趨化因子CXCL10、CCL2、CCL3、CXCL1 和 CXCL2，能夠募集T 細胞和其他免疫細胞增強抗腫瘤免疫［11］（圖1D）。TAN 還可以促進巨噬細胞分泌IL-12，促進非常規T 細胞（CD4-CD8-TCRαβ+double-negative unconventional T cells，UTCαβ）向Ⅰ型免疫反應的極化和IFN-γ 的產生［11］（圖1E）。TME 中存在的干擾素-γ（IFN-γ）和GM-CSF 能促進TAN 成熟為抗原呈遞細胞（antigen presenting cell，APC），表達主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類和Ⅱ類分子，刺激CD4+和CD8+T細胞的增殖和活化。有趣的是，有體外試驗表明TAN 釋放的中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）也可以引發和加強T 細胞的抗腫瘤免疫，但目前在癌癥患者的文獻報道中，NETs 均為促腫瘤作用，故NETs 在體內是否具備抗腫瘤作用尚需進一步的研究［1］。

圖1 TAN 的抗腫瘤作用Fig.1 Anti-tumor effects of TAN

2.2 促腫瘤作用在包括非小細胞肺癌、頭頸部腫瘤、黑色素瘤、肝細胞癌在內的多種腫瘤活檢樣本中，TAN 的浸潤程度與總生存率（overall survival，OS）呈負相關［12］，而術前較高的系統免疫炎癥指數和中性粒細胞淋巴細胞比值（neutrophils to lymphocytes ratio，NLR）與多種實體腫瘤的不良預后相關［13-14］。大量體外實驗和動物實驗也證實了TAN 通過多種途徑促進腫瘤進展：

通過釋放ROS 造成肺上皮細胞DNA 損傷：這種損傷本身比較輕微，但在致癌物存在的情況下可以被顯著放大，從而促進腫瘤的發生，即TAN 通過釋放ROS 提高了組織對致癌物質的敏感性［15］。此外，人和小鼠腸黏膜中活化的TAN 可通過釋放促炎癥的RNA 微粒，促進上皮細胞DNA 的雙鏈斷裂，造成基因組不穩定性，組織愈合受損，促進腫瘤發生［16］（圖2A）。

通過旁分泌信號通路刺激腫瘤細胞的增殖：在斑馬魚RAS 驅動的腫瘤模型研究中，TAN 通過釋放前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）或彈性蛋白酶直接促進腫瘤細胞的增殖。此外，白介素1受體拮抗劑（IL-1RA）可以對抗抑癌基因誘導的腫瘤細胞凋亡，間接促進腫瘤增殖（圖2B）。

通過抑制其他免疫細胞發揮促瘤作用［1］：TAN 除了通過ROS、iNOS 和精氨酸酶1（arginase 1，Arg1）等介質實現對T 細胞的直接抑制外［1］，還可以通過 CCL17、CCL2 募集腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAM）和調節性T細胞（regulatory T cells，Tregs）重塑TME，抑制T 細胞的抗腫瘤免疫。

通過代謝途徑塑造抑制性TME：在乳腺癌模型中，腫瘤誘導的中性粒細胞能夠通過參與線粒體氧化代謝來維持ROS 的產生以抑制T 細胞［17］。另有研究發現TAN 在分化過程中發生了糖酵解向脂肪酸氧化的轉變，通過上調脂肪酸轉運蛋白2（fatty acid transporter protein 2，FATP2），增加花生四烯酸（arachidonic acid，AA）的攝取和PGE2 的合成參與抑制性免疫微環境的形成。

通過表達免疫檢查點受體/配體來抑制其他免疫細胞：在人和小鼠肝癌模型及人類胃癌患者中，TAN 通過表達程序性細胞死亡蛋白配體1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）抑制T 細胞的抗腫瘤反應。而阻斷PD-1/PD-L1 后，T 細胞受到的免疫抑制減弱，浸潤和活化得到加強［18］（圖2D）。

促進腫瘤血管的生成：基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）與血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的激活、誘導、血管生成以及早期腫瘤生長有關，主要由腫瘤內TAN 和腫瘤周圍的巨噬細胞表達。CD11b+Gr1+TAN 表達的Bv8 蛋白上調可以促進小鼠腫瘤的血管生長，而抗Bv8 抗體可以抑制腫瘤的生長并抑制血管生成，提示TAN 可能在癌變早期通過MMP-9、Bv8 等促進腫瘤組織血管生成（圖2C）。

NETs 是一種TAN 胞膜破裂后釋放的網狀結構，主要由松散的DNA 骨架構成，其他成分還包括MMP9、中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、組織蛋白酶G（cathepsin G，CG）和髓系過氧化物酶（myeloid peroxidase，MPO）等［19］，NETs通過多種途徑促進腫瘤進展［20］（圖2B，D，E）。

圖2 TAN 的促腫瘤作用Fig.2 Pro-tumor effects of TAN

如前所述，TAN 通過不同的途徑在不同種類和臨床分期的腫瘤中發揮抗瘤或是促瘤的調控作用，針對這些可能的調控機制，目前已有多種藥物正在進行臨床試驗［6］，如TGFβ 抑制劑用于促進N1 型TAN 的發育，CXCR2 拮抗劑用于抑制TAN向腫瘤的募集，非甾體類藥物通過抑制COX2 抑制腫瘤細胞增殖并減輕前列腺素介導的免疫抑制等。即使如此，關于TAN 具體的抗腫瘤或促腫瘤作用機制目前仍不十分清楚，而鑒于TAN 亞群高度的異質性，筆者認為在具體的腫瘤類型中討論其調控作用可能更為合理。

3 TAN 在UBC 中的研究進展

UBC 被認為是一種高度免疫原性惡性腫瘤，包括非肌層浸潤性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer，NMIBC）和肌層浸潤性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer，MIBC），TAN 的雙向調控作用在UBC 臨床診療中具有巨大潛力。

3.1 NLR 用于預測UBC 預后多項研究證實外周血NLR與UBC較差的臨床預后相關［21-22］，NLR值與腫瘤的分級、分期顯著相關，還與NMIBC 患者的高復發風險有關。在一項回顧性分析中，899例UBC患者行根治性膀胱全切術而未行其他輔助治療，其中，術前較高的NLR 與患者病理分級、膀胱外腫瘤侵犯以及淋巴結轉移相關，術前NLR ≥ 2.7 的患者，10年腫瘤特異性生存率更低。因此，NLR 被認為是預測膀胱癌患者預后、分層的重要指標［22-23］。NLR 也被一些研究作為預測高危NMIBC 對BCG 治療反應性的工具，可為高危NMIBC 患者提供個體化的治療方案［24］。需要指出的是，絕大多數研究中采用的NLR 指標只能反映外周血中中性粒細胞的數量，并不能反映TME中真實的TAN浸潤情況。

3.2 靶向TAN 與其他UBC 經典治療的聯合對于高危NMIBC，經尿道膀胱腫瘤電切術加BCG 膀胱內灌注治療可以有效降低術后復發率以及腫瘤的進展率。然而一些患者對BCG 治療并不敏感，而有研究認為NLR 可以作為預測高危NMIBC 對BCG 治療反應性的工具，并根據評估結果為NMIBC 患者提供最佳的治療方案［24］

大量研究表明TAN 與MIBC 患者較差的化療、放療反應性以及較低的生存率相關，并且TAN 促進腫瘤發生、進展與轉移的功能也在一些腫瘤模型中得到驗證，靶向TAN 并聯合經典放、化療的療法顯示出一定潛在應用價值。研究表明，UBC 腫瘤細胞可以通過對上調CXCL1、CXCL8，促進TAN分泌VEGFA 和MMP9，促進淋巴管的形成和淋巴結的轉移［25］，提示靶向TAN 可能具有抑制UBC 淋巴結轉移的潛力。然而有研究表明并不是所有的TAN 浸潤水平升高都意味著更差的預后，有文獻報道在病理分期為pT2N0M0 時，CCR5+TAN 浸潤水平與TNM 分期呈負相關，并且對輔助化療和ICIs 治療有更好的反應性［26］。相較于管腔內生型乳頭狀MIBC，基底型MIBC 顯示出明顯更高水平的趨化因子吸引中性粒細胞浸潤，而二者不同的腫瘤免疫微環境也提示兩種類型的MIBC 可能受益于完全不同的治療方法［27］。

3.3 靶向于TAN 的腫瘤治療策略及困境基于目前的研究結果，靶向于TAN 的腫瘤治療策略大致分為兩類。首先是通過直接耗竭TAN 或抑制其在TME 中的募集，從而減少N2 亞群的促腫瘤作用，然而，考慮到嚴重甚至致命感染的明顯風險，全身性的中性粒細胞耗竭策略在臨床上是不現實的。其次是通過各種辦法干預體內TAN 的功能表型，減少N2 亞群的同時增加N1 亞群，其中最常用的方法是阻斷TGF-β 或以IFN-β、高劑量的G-CSF誘導，促進TAN 的抗腫瘤潛能，但目前對于TAN亞型的極化機制知之甚少，甚至連誘導后的TAN亞群也無法做到精確的標識和鑒別，盡管如此，TAN 亞群的極化和重塑仍被認為是重要的和潛力巨大的腫瘤治療策略。也有人提出從外周血提取抗瘤的N1 后再進行外源性輸注的技術，然而，這些針對TAN 的全身性操作可能會引起嚴重的不良事件，如急性肺損傷［6］，并且由于TAN 本身壽命較短，無法長期保持功能狀態，需要多次、大量輸注粒細胞，存在嚴重不良反應風險等缺點，該技術的臨床應用仍存在爭議。

雖然大量研究顯示出TAN 雙向調控在腫瘤治療中的臨床應用潛力，但鑒于目前的研究結果大部分來源于體外試驗或動物實驗，這些結論在人體內是否也同樣成立尚不得而知，筆者認為，靶向TAN 的腫瘤治療策略要取得進一步的突破，依賴于對TAN 亞群更深入的研究和更精準的分型，并以此為前提揭示TAN 不同的亞群募集和極化過程中的確切重塑機制。此外，還需要構建更加接近于臨床的研究模型，在已有研究成果的基礎上進一步討論TAN 在復雜環境下對腫瘤的調控作用。

4 總結

綜上所述，TAN 因其可塑性和復雜的發育分化過程，在不同腫瘤或組織形成具有明顯功能表型差異的異質性亞群，這些亞群表現出抗瘤和促瘤的雙向調控作用，深刻影響著腫瘤發生、進展和轉移過程。目前的研究顯示出TAN 應用潛力的同時面臨較多未知和挑戰，進一步揭示TAN 亞群分型和極化的機制是下一步研究的關鍵，有望為新一代腫瘤治療提供新的靶點。

【Author contributions】DENG Kai wrote and revised the article.YANG Meng ，ZHANG Ling，QIAN Jun'an，SHI Yun-qiang revised the article.WANG Chunhui reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.