野菊花顆粒對COPD模型大鼠氣道炎癥與重塑及MMP-9/TIMP-1平衡的影響

黃勇 蘇韞 龔紅霞 曾元丁 李春波 李婷婷

(甘肅中醫藥大學甘肅省高校重大疾病分子醫學與中醫藥防治研究省級重點實驗室,甘肅 蘭州 730000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)發病主要機制中慢性炎癥起重要作用,其中慢性發炎所導致的氣道重塑也是最主要的疾病特征之一。慢性氣道炎癥和氣道重構變化由許多原因引起,導致不斷出現的呼吸系統體征和氣流問題受限〔1～3〕。研究證實,基質金屬蛋白酶(MMP)-9在胞外基質破壞中發揮重要作用,促使細胞外基質(ECM)大量堆積,并引起氣道重塑〔4,5〕。MMP組織抑制因子(TIMP)-1為MMP-9的抑制劑,能夠特異性控制MMP-9,而MMP-9/TIMP-1平衡在COPD發生機制中起關鍵調節作用。本實驗通過現代制劑工藝技術提取野菊花有效成分,制備野菊花顆粒,觀察野菊花顆粒對COPD大鼠氣道炎癥反應及MMP-9、TIMP-1表達的影響,探討野菊花顆粒在治療COPD中的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 SPF級Wistar大鼠72只,雌雄各一半,體質量180～220 g〔甘肅中醫藥大學科研實驗中心,動物質量檢測合格證編號:62001000000165;許可編號:SCXK(甘)2011-0001〕。各組適應性喂養3 d,隨機分為空白組,模型組,醋酸潑尼松(陽性對照)組,野菊花顆粒高、中、低劑量組。

1.2野菊花顆粒制備方法〔6〕稱重選取野菊花中藥材,在藥材中加入12倍的純水。先使用蒸餾法將藥材放入水蒸氣中5用于提取揮發油,再采集揮發油。將藥渣與水提液兩者濾過分開,保留其中的水提液,在濾出的藥渣中再加入8倍的水回流萃取1 h,過濾得到水提液,水提液合并后濃縮至相當于最初藥材量質量比的5倍,加入一定量的乙醇靜置至60%沉淀,在經過高速離心后,吸取上清液減壓濃縮到需要的濃度。在之前提取的揮發油中加入泊洛沙姆188研磨均勻后再加入少量的濃縮藥液制作成初乳。而野菊花提取液是由揮發油初乳加上濃縮藥液混勻構成。濃縮至稠膏狀(藥物相對密度為D1.40,即每毫升濃縮液里含藥物1.40 g),60 ℃ 常壓烘干,粉碎至40目成顆粒即可。

1.3模型制備 各組大鼠使用注射器在腹腔注射烏拉坦(1.4 g/kg)麻醉后,將其放置固定于操作臺上呈仰臥位,進行消毒,沿氣管平行方向剪開頸部,將氣管暴露出,使用4號針頭刺入氣管,空白組注入生理鹽水,其余組均注入1 g/L的脂多糖200 μl建立COPD模型〔7,8〕;造模第2天起,空白組和模型組每日灌服等容積生理鹽水,給予陽性對照組醋酸潑尼松0.040 5 mg/(ml·d),野菊花低、中、高劑量組分別給予0.7、1.4、2.8 g/(kg·d)野菊花顆粒灌胃,共28 d。

1.4生化法檢測支氣管肺部組織羥脯氨酸濃度 治療28 d后,將各組大鼠右側肺組織取出,結扎支氣管,并注入磷酸鹽緩沖液(PBS)進行支氣管肺泡灌洗,采集灌洗液備用。生化法分別檢測支氣管肺組織和血清中羥脯氨酸的濃度。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察各組右肺組織病理學形態 處死大鼠,剖開胸腔,剝離肺組織,將大鼠右肺組織置于4%多聚甲醛固定液中固定,石蠟包埋后進行切片,依次進行梯度二甲苯脫蠟,酒精梯度脫水,蘇木素染色,水洗,鹽酸酒精,水洗,酒精梯度脫水,伊紅染色,酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片后在光學顯微鏡下觀察其病理變化。

1.6免疫組織蛋白法檢測各組肺組織MMP-9和TIMP-1蛋白表達 將石蠟切片常規脫蠟后清洗3次,3%H2O2封閉10 min,PBS徹底清洗切片3次,每次5 min;然后進行抗原修復,加入一抗,濕盒4 ℃過夜后加入二抗,37 ℃孵育30 min,二氨基聯苯胺(DAB)顯色,脫水封片后與光學顯微鏡下觀察。蛋白陽性表達顯示為細胞內出現棕黃色顆粒。在圖像分析系統(CX21 型生物顯微鏡,日本 OLYMPUS 公司;MiE 圖像處理系統,山東易創電子有限公司;BI-2000醫學圖像分析系統,成都泰盟科技有限公司) 20 倍物鏡下,每張切片隨機選取 5 個視野,測定肺組織內MMP-9和TIMP-1表達顆粒的積分光密度,取其平均值作為該只大鼠的肺組織MMP-9和TIMP-1蛋白相對表達量。

1.7實時(Real-time)熒光定量PCR檢測MMP-9和TIMP-1 mRNA表達 肺組織取材后,提取總RNA,反轉錄為cDNA。進行PCR,反應條件為:預變性95 ℃ 5 min,變性95 ℃ 10 s,退火60 ℃ 20 s,延伸72 ℃ 20 s,共循環40次。運用相對表達量2-ΔΔCt法進行數據分析。引物序列(5′→3′):MMP-9正向:CATGCGCTGGGCTTAGATCA,反向:GAGGCCTTGG-GTCAGGTTTAGAG,156 bp;TIMP-1正向:CATCTCTGGCCTCTGGCATC,反向:CATAACGCTGGTATAAGGTGGTCTC,148 bp;GAPDH正向:TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC,反向:AAGATGGTGATGGGCTTCCCG,130 bp。

1.8統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組羥脯氨酸含量 與空白組比較,模型組羥脯氨酸含量異常增高(P<0.01);與模型組比較,陽性對照組、野菊花各劑量組羥脯氨酸含量表達均顯著減弱(P<0.05,P<0.01)。見表1。

表1 各組肺組織羥脯胺酸含量、MMP-9和TIMP-1 mRNA及蛋白表達比較

2.2MMP-9和TIMP-1蛋白表達 免疫組化結果表明,MMP-9、TIMP-1陽性表達主要位于細胞質,呈棕黃色或黃褐色顆粒。與空白組相比,模型組MMP-9、TIMP-1陽性表達著色較深,光密度值顯著升高(P<0.05);與模型組比較,醋酸潑尼松組及野菊花高、中、低劑量組陽性表達著色較淺,光密度值明顯降低(P<0.05),見表1、圖1。

2.3MMP-9和TIMP-1 mRNA表達 與空白組相比,模型組MMP-9、TIMP-1 mRNA 表達明顯增高(P<0.01);與模型組相比,野菊花高、中劑量組和醋酸潑尼松組MMP-9、TIMP-1 mRNA表達顯著降低(P<0.05,P<0.01),見表1。

2.4大鼠肺組織病理學形態觀察 HE結果表明,空白組肺部組織及支氣管結構完好,黏膜表面光滑且腺體無增生,管壁各層均無明顯炎性細胞浸潤,支氣管腔內也無滲出物。模型組支氣管黏膜上皮出現變性脫落,黏膜層明顯充血、水腫,視野中可見炎性細胞大量浸潤。與模型組比較,陽性對照組炎癥減輕,細支氣管腔內可見排出少許分泌物,炎性細胞浸潤程度較輕。野菊花高劑量組可見肺組織少量炎性細胞浸潤,支氣管壁結構完整、黏膜充血顯著減輕、腔內無明顯分泌物,病變嚴重程度減低,病變區域縮小。野菊花中劑量組肺組織構造完整,支氣管壁增厚不明顯,黏液分泌物減少,較少炎性細胞浸潤。野菊花低劑量組肺組織病變程度接近模型組,大量炎性細胞浸潤,支氣管管壁增厚明顯,分泌物明顯增多,見圖2。

3 討 論

目前普遍認為MMP-9/TIMP-1系統的失衡是COPD發病中氣道重塑的主要機制之一。ECM的降解和沉積失衡在COPD發生氣道重構、肺實質破壞及間質增生中扮演著重要的角色〔8,9〕。而MMPs在調節ECM代謝中也起到了主要作用。MMP-9作為主要限速酶是MMPs家族的一員,可以保障肺基底膜及其結構支架的完整性、并在合成與降解平衡ECM中起至關重要的作用,與氣道重塑發生、發展密不可分〔10〕。在正常組織中MMP-9的表達極低,但是在一定刺激下其表達量升高例如炎性細胞因子。TIMPs能夠抑制MMPs的活性,具有改變正常ECM及各種病理過程的作用。其中,TIMP-1能夠特異性抑制MMP-9的生物學效應,從而降低基質的降解,主要作用于阻斷MMP-9的活化及抑制已活化的MMP-9活性兩部分。因此,TIMP-1表達升高代表了氣道修復及重塑過程,是氣道纖維化的重要標志。在氣道進行炎癥和重塑的步驟中,MMP-9/TIMP-1系統失衡,會降解大量ECM成分,嚴重破壞基底膜。MMP-9升高,氣道炎癥反應增強,導致組織破壞;TIMP-1升高,可以修復氣道,導致組織重建。因此在炎癥損傷和氣道重塑階段,抑制MMP-9和TIMP-1的過度表達,使MMP-9/TIMP-1系統平衡,成為阻止氣道重塑的有效途徑之一。

COPD在祖國醫學中可歸屬于“痰飲”“肺脹”“喘證”等范疇,其病位主要在肺,并涉及脾、腎、肝。病因包括吸煙等,吸煙導致人體內津化為痰,得氣機運行受阻,生瘀化熱〔11〕。COPD急性發作期中醫病機主要為痰熱夾瘀,治法上以祛痰化瘀,宣肺泄熱為主〔12〕。野菊花性涼,味苦、辛,歸肺、肝經,具有清熱解毒、消散癰腫、疏風平肝之功效。現代藥理研究表明,其活性成分主要有黃酮類、揮發油類、多糖、有機酸及微量元素等,具有良好具有抗炎和免疫調節抑菌、抗病毒、抗氧化、肝保護、降血壓、降血脂及抗腫瘤等藥理作用〔13,14〕。有研究表明〔15〕,野菊花能通過核轉錄因子(NF)-κB和絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號通路抑制脂多糖誘導的炎性因子產生,從而產生免疫調節作用。

本研究結果表明,結締組織大量增生與破壞,發生氣道結構重建。MMP-9、TIMP-1表達升高,表明氣道發生炎癥反應和氣道重塑。而各治療組較模型組相比,羥脯氨酸含量下降,MMP-9、TIMP-1表達降低,表明野菊花顆粒對COPD大鼠模型氣道炎癥與重塑具有抑制作用,野菊花顆粒明顯降低了COPD模型大鼠肺組織中羥脯氨酸濃度和MMP-9、TIMP-1的表達水平,從而減輕氣道炎癥與重塑,為臨床用于治療COPD提供了科學依據。