基于NLRP3/caspase-1通路沉默I-Aβ1基因對腎小球腎炎系膜增殖的影響

董麗娜 劉國平 劉艾芹 于磊

(內蒙古自治區人民醫院腎臟內科,內蒙古 呼和浩特 010017)

腎小球腎炎是一類常見的腎臟炎癥類疾病,其中依據病理類型又可分為膜性腎小球腎炎、系膜增生性腎小球腎炎等,且大多數患者治療后預后性較差〔1,2〕。近年來腎小球腎炎發病年齡逐漸降低,其發病率逐年加劇升高,嚴重危害著患者的身心健康〔3～6〕。腎小球腎炎特點是發病快,前期大多主要表現為上呼吸道感染,隨后表現為無癥狀性血尿等癥狀,嚴重者可發展為腎病綜合征〔7～9〕。腎小球腎炎是根據病理檢查、病理形態學診斷的腎炎,是一種以彌漫性腎小球系膜細胞增生和多種程度系膜基質增多為特征的腎臟類炎癥〔10〕。NOD受體(NLRP)3是近些年新出現的有關基因表達調控的信號通路,在炎癥的發生、發展過程中起著明顯的控制作用〔11〕。NLRP3的激活是腎小球腎炎病理過程中的重要步驟,研究NLRP3對于治療腎小球腎炎具有重要意義。半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-1是半胱氨酸蛋白酶家族中的一種,其存在于人體各種細胞質當中,其起著監督炎癥發生、監測細胞死亡的作用〔12〕。caspase-1是一種重要的轉錄因子,病理反應主要是提高炎性因子分泌量,使患者病情加重。基于上述研究背景,在本文研究中基于NLRP3/caspase-1信號通路研究沉默免疫應答基因(I-Aβ1)是否會優化腎小球腎炎,對腎小球腎炎系膜細胞的增殖功能產生了如何影響,以便為診斷、控制、預防腎小球腎炎提供理論參考。

1 對象與方法

1.1材料 研究細胞:人系膜增生性腎小球腎炎細胞(MsPGN),購自上海雅吉生物科技有限公司,貨號:E01666,本研究操作已獲醫院倫理委員會審批同意,且嚴格按照倫理要求相關規定進行。主要試劑:RPMI1640由上海吉至生化科技有限公司提供,貨號:A90022S;胎牛血清由上海江林生物科技有限公司提供,貨號:10270-106;I-Aβ1基因由上海彩佑實業有限公司提供,貨號:YS-2191F;Trizol試劑由武漢純度生物科技有限公司提供,貨號:CD-102523GM;磷酸鹽緩沖液(PBS)由上海廣銳生物科技有限公司提供,貨號:PR694;NLRP3抗體由武漢菲恩生物科技有限公司提供,貨號:FNab10120;caspase-1抗體由武漢益普生物科技有限公司提供,貨號:ATA25867。

1.2方法

1.2.1腎小球腎炎MsPGN細胞培育 先用雙抗的RPMI1640、12%胎牛血清完全培養基,保存溫度為37 ℃培養已購買的人系膜增生性腎小球腎炎MsPGN細胞,每隔4 d替換新鮮培養液,當細胞融合度達到在72%以上時,開始傳代培養。選擇人系膜增生性腎小球腎炎MsPGN細胞,并分為對照組、過表達組、沉默組。

1.2.2腎小球腎炎MsPGN細胞內I-Aβ1指標轉染 對照組不做處理,過表達組轉染I-Aβ1模擬物(mimics)上調載體,沉默組轉染I-Aβ1抑制劑(inhibitor)下調載體。I-Aβ1 mimics序列:上游引物5′-CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA-3′,下游5′-AGACCGAGACAAGUGCAAUGUU-3′;I-Aβ1 inhibitor序列:上游引物5′-UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC-3′,下游5′-AGGCCGGGACGAGUGCAAUAUU-3′,在轉染過程中,每組培養基濃度均保持在120 nmol/L。

1.2.3腎小球腎炎MsPGN細胞內I-Aβ1指標檢測 采用實時熒光定量PCR法檢測I-Aβ1指標。選取轉染72 h對照組、過表達組、沉默組I-Aβ1細胞,并用Trizol試劑提取,將采集到的總RNA通過逆轉錄合成cDNA,配制反應體系需選用各組2 μl的RNA樣本,0.78、1.23、4.56、0.27 μl的RNA的反轉錄(RT)、脫氧核苷酸三磷酸酯(dNTPs)、5 ml緩沖液、逆轉錄酶(MMLV),保持在15 ℃下,35 min。組建RT-PCR體系,其中包含1.33 μl、7.67 μl、1.2 μl、0.1 ml的無核酸酶水、cDNA、引物、探針混合物及通用混合物,小核RNA作為內部。其中,I-Aβ1序列:上游引物5′-GGGCGGAATTGCACTTGTC-3′,下游5′-CTCAACTGGTGGTGTCGTGGAGTC-3′,反應20 min,保持溫度在80 ℃,接著50 ℃下反應10 min,循環40次,記錄數值,即為I-Aβ1表達量。

1.2.4雙熒光素酶報告基因實驗 采用Targetscan靶基因軟件利用熒光素酶系統分析I-Aβ1和NLRP3/caspase-1信號通路的關系,檢測熒光素酶活力,將組建的NLRP3/caspase-1野生型與NLRP3/caspase-1突變型的雙熒光素酶報告載體均與I-Aβ1 mimics、I-Aβ1 inhibitor一起轉染到放置腎小球腎炎細胞的培養皿中,經轉染2 d后,采集細胞,并在室溫下,進行裂解,加入熒光素酶底物,其中,內參為熒光素酶活性,讀取、記錄熒光素酶活性數值。

1.2.5檢測腎小球腎炎系膜細胞增殖、凋亡方法 使用MTT法檢測腎小球腎炎系膜細胞增殖率,每個組胰酶進行分解,形成單細胞懸液,離心7 min,丟棄上清液,使用5 ℃的洗液,洗滌2次。取配制的單細胞懸液,加0.23 ml、0.5 ml的噻唑藍(MTT)、70%乙醇,在-24 ℃下固定,并在5 ℃下,放置12 h并離心9 min,洗液洗滌3次,置于無光環境下,用碘化丙啶液染色,用SpectraMax Paradigm卡盒式多功能酶標儀(美谷分子儀器有限公司 上海)測定OD值,計算增殖率。用Agilent NovoCyte 流式細胞儀(安捷倫科技公司 美國)檢測腎小球腎炎系膜細胞凋亡率。

1.2.6檢測腎小球腎炎MsPGN細胞遷移、侵襲 使用Transwell小室檢測每組腎小球腎炎MsPGN細胞侵襲數,培養板置于Transwell小室,下室倒入120 ng/ml反應溶液、上室倒入細胞懸液、靜放2 d,用三羥甲基丙烷溶液對培養板進行處理,PBS洗滌5次,每次洗滌5 min,固定并用蘇木素染色,洗滌后顯微鏡下觀察上室細胞數,記錄6個視野內細胞數的平均值,重復4次,取MsPGN細胞侵襲數平均值。用劃痕實驗檢測MsPGN細胞遷移數,選取MsPGN細胞用胰蛋白酶分解,獲取細胞懸液接種到6孔板上,并用0.013 ml移液器槍頭將全部單層MsPGN細胞,從上至下畫一條劃痕,用PBS洗滌刮下細胞,向干凈培養基中加入3 ml的溶液,37 ℃下培育30 h,棄去培養液,顯微鏡下觀察并記錄4個視野平均值,重復4次,取MsPGN細胞遷移數平均值。

1.2.7檢測NLRP3/caspase-1信號通路表達量方法 采用Western印跡法檢測NLRP3/caspase-1信號通路表達量。選取系膜細胞,采集20 μg蛋白質樣本,電泳95 min,轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜,室溫下,封閉處理,添加1∶1 500的TBST供給稀釋的NLRP3一抗,使用濃度為0.08%的辣根過氧化氫酶標記caspase-1二抗,于室溫下培育,在避光環境下,采用電化學發光(ECL),進行顯色30 min,然后采用LABWORK凝膠圖像,進行掃描操作,獲取膠片,計算NLRP3、caspase-1表達量。

1.3統計學處理 采用SPSS26.0統計軟件進行獨立樣本t檢驗、F檢驗。

2 結 果

2.1I-Aβ1轉染效率分析 如表1所示,與對照組比較,過表達組I-Aβ1表達量升高及沉默組I-Aβ1表達量降低,具有統計學差異(P<0.05);與過表達組比較,沉默組I-Aβ1表達量降低,具有統計學差異(P<0.05),說明I-Aβ1轉染成功。

表1 各組I-Aβ1轉染效率分析及系膜細胞增殖、凋亡率、MsPGN細胞遷移、侵襲數比較

2.2系膜細胞增殖、凋亡率 如表1所示,與對照組比較,過表達組24、48、72 h系膜細胞增殖率降低,凋亡率升高,沉默組24、48、72 h系膜細胞增殖率升高,凋亡率降低,具有統計學差異(P<0.05);與過表達組比較,沉默組24、48、72 h系膜細胞增殖率升高,凋亡率降低,具有統計學差異(P<0.05)。

2.3MsPGN細胞遷移、侵襲數 如表1所示,與對照組比較,過表達組MsPGN細胞遷移數、侵襲數增多,沉默組MsPGN細胞遷移數、侵襲數減少,具有統計學差異(P<0.05);與過表達組比較,沉默組MsPGN細胞遷移數、侵襲數減少,具有統計學差異(P<0.05)。

2.4雙熒光素酶報告基因結果 如表2所示,雙熒光素酶報告基因結果顯示,與沉默組相比,過表達組NLRP3/caspase-1野生型熒光素酶活性升高,具有統計學差異(P<0.05);NLRP3/caspase-1突變型熒光素酶活性無統計學差異(P>0.05)。

表2 兩組熒光素酶活性比較

2.5NLRP3/caspase-1信號通路蛋白表達量分析 如表3所示,與對照組比較,過表達組NLRP3、caspase-1升高,沉默組NLRP3、caspase-1降低,具有統計學差異(P<0.05);與過表達組比較,沉默組NLRP3、caspase-1降低,具有統計學差異(P<0.05)。

表3 各組NLRP3/caspase-1信號通路蛋白表達量比較

3 討 論

臨床研究證實〔13〕,I-Aβ1基因可以調節人體大約1/4微小RNA表達,其中I-Aβ1在腎小球腎炎、腎結石、腎動脈狹窄等疾病呈現異常,同時與炎癥的出現、進展、增加、遷移有著密切聯系。I-Aβ1參加腎小球腎炎細胞的發展、產生、侵襲及遷移過程,多種腎臟類疾病與其表達水平關系密切,如在腎萎縮中,經下調I-Aβ1水平增強腎臟穩態健康細胞的抗凋亡、侵襲、遷移能力。I-Aβ1經靶向刺激腎小球腎炎細胞大面積轉移、增殖,也可通過沉默NLRP3/caspase-1信號通路蛋白表達,改變MsPGN細胞的遷移、侵襲速度,進而影響腎小球腎炎系膜細胞的增殖表現。本研究結果表示,沉默I-Aβ1基因可改變MsPGN細胞、系膜細胞的生物活性,當抑制I-Aβ1表達,MsPGN細胞的感染能力將會大幅度減弱,對患者病情治愈起到促進效果。

NLRP3信號通路可調控多數炎性因子、逆序靶基因的活性,刺激炎癥相關的細胞活化,致使轉錄因子加速誘導細胞增殖、分化、轉移、侵襲能力,增強細胞抗凋亡作用。有研究證實〔14～16〕,NLRP3信號通路參加炎癥有關調控,經常與促炎性因子、I-Aβ1基因等表達物質相互反應,使炎性因子分泌增加,進而加快疾病進展。NLRP3信號通路調控靶基因細胞周期蛋白失常,可對腎小球腎炎MsPGN細胞轉移進行預測,起到對腎臟類疾病的預測作用〔17～19〕。本研究結果表示,NLRP3信號通路通過與細胞膜受體結合,刺激受體蛋白,影響炎癥細胞的分解,改變腎小球腎炎疾病進展。NLRP3信號通路可通過與I-Aβ1基因反應,刺激健康穩態細胞信號傳導,發揮調控細胞分化、增殖的極性作用。臨床可調控NLRP3信號通路蛋白表達,從而實現控制腎小球腎炎MsPGN細胞的各項能力,加速患者病情治愈。

研究證實〔20～22〕,caspase-1分布于除紅細胞外的各種細胞中,其本身是半胱氨酸蛋白酶家族的一種,形態以酶原形式存在,在腎小球腎炎細胞中起著引誘炎癥發生、促進健康穩態細胞死亡等功能。通過本研究可發現,caspase-1、NLRP3兩者互相協調,兩者兼具促炎性。caspase-1可通過對炎性因子控制,影響患者腎小球腎炎疾病發展,同時破壞著患者腎小球腎炎系膜細胞的存活,嚴重影響著患者腎臟系膜細胞的增殖率〔23〕。caspase-1信號通路表達升高能促進病毒感染情況下免疫逃逸,因而判定caspase-1信號通路能降低腎臟中健康穩態細胞效應功能,成為MsPGN細胞的一種逃逸方式,進而影響腎小球腎炎的治療進展。本研究結果表示,NLRP3/caspase-1信號通路影響著腎小球腎炎的進程,NLRP3/caspase-1信號通路對腎小球腎炎耐受機制提供了臨床研究線索,對腎小球腎炎的治療、聯合治療具有重要意義。雖然本研究認為,沉默I-Aβ1基因可改變腎小球腎炎系膜增殖情況,但目前臨床上并未有研究經其應用于腎小球腎炎NLRP3/caspase-1信號通路的研究中,因此上述研究需后續研究進一步分析驗證。

綜上所述,基于NLRP3/caspase-1信號通路中的I-Aβ1基因互相表達、呈緊密聯系,其對腎小球腎病細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等各項指標起到明顯的調節作用,通過調控NLRP3/caspase-1信號通路表達,從而使腎小球腎病炎癥細胞凋亡,優化系膜細胞增殖表達,為臨床診治腎小球腎病提供理論依據。