鎘脅迫對3種草坪草生理特性及葉片超微結構的影響

張秀娟, 范 玟, 楊 樂, 吳 楚, 楊永勝

(1.長江大學園藝園林學院, 湖北 荊州 434025; 2.中國科學院西北高原生物研究所, 青海省寒區恢復生態學重點實驗室, 中國科學院高原生物適應與進化重點實驗室, 青海 西寧 810001)

隨著我國工農業和城鎮化的快速發展,工礦業廢棄污染物不斷排放和農業化學用品過量使用,越來越多的重金屬進入土壤,土壤環境污染日益嚴重。我國土壤重金屬總的點位超標率為16.1%,其中鎘的點位超標率達7.0%,在無機污染物中位居首位[1]。鎘是一種有劇毒的稀有污染重金屬,危害動植物及人類的健康[2],且半衰期較長,遷移率較高,生物富集特性較強,屬于需要優先控制的重金屬污染物[3]。鎘脅迫加強植物細胞內固有的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)代謝,若ROS水平超出抗氧化酶的防御機制,將引起植物細胞膜過氧化,葉綠體基粒片層結構排列混亂,細胞器損傷嚴重,光合色素含量降低[4]。植物修復技術是利用超富集植物來穩定降解土壤中的污染物[5],具有成本低、綠色環保、對環境干擾小等優點[6]。近年來,對鎘污染土壤下植物生理特性的研究較多,例如小麥(Triticumaestivum)[7]、玉米(Zeamays)[8]、龍葵(Solanumnigrum)[9]、杞柳(Salixintegra)[10]以及鬼針草(Bidenspilosa)[11]等。然而,選用這些植物在修復鎘污染方面存在一定缺陷,一是選用農作物會通過食物鏈傳播危害人類健康,二是因生物量太低而限制了在實際中的應用。利用草坪草修復鎘污染的土壤,其產物不會進入食物鏈且生物量大、安全性強、適用性廣[12],同時具備修復治理和美化環境的雙重作用[6],因此,草坪草修復鎘污染土壤具有獨特優勢。

白三葉(Trifoliumrepens)為豆科車軸草屬草坪草,具有適應性強,耐熱、耐旱、耐寒、耐貧瘠等優點,是極為重要的優質牧草和觀賞型草坪草。禾本科的高羊茅(Festucaarundinacea)和黑麥草(Loliumperenne)是有重要農學價值的冷季型草坪草,其根系發達、適應范圍廣、抗逆性強,廣泛用于綠地草坪和運動場草坪,同時也可作為牧草和綠肥作物。已有研究發現這3種草坪草對重金屬有一定的耐受能力[13-15],均有修復重金屬污染土壤的潛力。因此,本研究以白三葉、高羊茅、黑麥草為試驗材料,探討這3種草坪草受到鎘脅迫后的生理特性及葉片細胞超微結構的變化,從生理學和細胞學上揭示鎘對草坪草的毒害機理,以期為利用草坪草修復鎘污染的土壤提供科學依據。

1 材料及方法

1.1 試驗材料

本試驗中白三葉(‘法海’)、高羊茅(‘凱撒’)、黑麥草(‘綠洲’)的種子從北京克勞沃生態科技有限公司獲得;選用的育苗基質購于一畝田農業科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1試驗設計 本試驗中3種草坪草的培養溫度均為20℃～25℃;相對濕度為50%～60%;光照周期為12 h光照/12 h黑暗交替進行。Cd2+設置處理濃度為0,200,500,1 000,2 000 mg·kg-1,每個處理設置6個重復,將不同質量的氯化鎘與基質混合均勻,裝入無污染的花盆中(d=15 cm,h=11 cm),每種草坪草種植30盆,每2天澆一次水(不含Cd2+或肥料),澆水標準以達到田間持水量的75%～80%為準,澆水時確保無鎘溶液滲漏,待60 d后測定其各項生理指標并觀察葉片細胞超微結構。

1.2.2生理指標的測定 葉綠素含量采用乙醇-丙酮提取法[16]測定;超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性采用氮藍四唑法測定[17];過氧化物酶(Peroxidase,POD)活性按張以順等[18]的方法測定;過氧化氫(Catalase,CAT)活性按蒼晶等[19]的方法測定;丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定[20]。

1.2.3葉片超顯微結構觀察 高羊茅和黑麥草選取Cd2+濃度為0,500,2 000 mg·kg-1成熟葉片進行切片觀察,因白三葉在Cd2+濃度為2 000 mg·kg-1時死亡,故選取Cd2+濃度為1 000 mg·kg-1成熟葉片。在顯微鏡下切成6片1 mm×1 mm的葉塊,參照鄭敏娜等[21]的方法處理葉片組織,在HITACHI—H7500型投射電鏡下觀察拍照。

1.3 數據分析處理

試驗數據采用SPSS 20.0軟件最小顯著差異法進行多重比較(P<0.05),數據處理用EXCEL 2007,作圖使用Origin 2019。

2 結果與分析

2.1 Cd2+脅迫對草坪草光合色素的影響

3種草坪草的葉綠素含量隨Cd2+濃度增加而降低(表1)。白三葉葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量及類胡蘿卜素含量在Cd2+濃度為1 000 mg·kg-1時僅為對照的9%～18%,其差異達到極顯著水平(P<0.01);其葉綠素b含量在Cd2+濃度200和500 mg·kg-1時為對照的55%和41%,差異顯著(P<0.05);其總葉綠素含量和類胡蘿卜素含量在Cd2+濃度500 mg·kg-1時分別為對照的57%和33%,差異顯著(P<0.05)。

表1 不同濃度Cd2+對3種草坪草光合色素含量的影響

與對照相比,不同濃度Cd2+處理下高羊茅的葉綠素a和總葉綠素含量的差異達到極顯著水平(P<0.01);其葉綠素b含量在Cd2+濃度200 mg·kg-1時為對照的60%,顯著低于對照(P<0.05),在Cd2+濃度500～2 000 mg·kg-1時其葉綠素b含量較對照差異達極顯著水平(P<0.01);其類胡蘿卜素含量在Cd2+濃度為1 000 mg·kg-1時,較對照顯著降低50%(P<0.05),在Cd2+濃度為2 000 mg·kg-1時較對照降低66%,差異達極顯著水平(P<0.01)。

黑麥草葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量在Cd2+濃度1 000 mg·kg-1時為對照的57%～58%,顯著低于對照(P<0.05),在Cd2+濃度2 000 mg·kg-1時為對照的31%～38%,差異達極顯著水平(P<0.01),其類胡蘿卜素含量在Cd2+濃度2 000 mg·kg-1時為對照的37%,其差異顯著(P<0.05)。

2.2 Cd2+脅迫對草坪草抗氧化酶活性及MDA含量的影響

白三葉SOD活性隨著Cd2+濃度增加而上升(圖1A),在Cd2+濃度為500和1 000 mg·kg-1時分別較對照上升131%和162%,其差異達到極顯著水平(P<0.01)。高羊茅的SOD活性在Cd2+濃度為1 000 mg·kg-1時SOD活性最高,與對照相比差異極顯著(圖1A,P<0.01),在Cd2+濃度為200和2 000 mg·kg-1時,SOD活性較對照顯著上升42%和53%(P<0.05)。黑麥草的SOD活性隨著Cd2+濃度增加表現出先升后降再升的趨勢,其SOD活性在Cd2+濃度為200～2000 mg·kg-1時較對照升高106%和203%,其差異達極顯著水平(圖1A,P<0.01)。

圖1 不同濃度Cd2+處理對3種草坪草抗氧化酶活性和MDA含量的影響

白三葉POD活性隨著Cd2+濃度增加呈先升后降再升趨勢(圖1B),在Cd2+濃度為200和1 000 mg·kg-1時較對照升高75%和186%,其差異極顯著(P<0.01)。高羊茅的POD活性隨著Cd2+濃度增加而升高,在Cd2+濃度為500,1 000,2 000 mg·kg-1時分別為對照的2.6,3,3.9倍,其差異達極顯著水平(圖1B,P<0.01)。黑麥草的POD活性變化趨勢與白三葉一致,均隨著Cd2+濃度增加呈先升后降再升趨勢,在Cd2+濃度為2 000 mg·kg-1較對照上升74%,其差異極顯著(圖1B,P<0.01)。

白三葉CAT活性隨著Cd2+濃度增加而上升,在Cd2+濃度為200和500 mg·kg-1時與對照相比差異并不顯著(圖1C),在Cd2+濃度1 000 mg·kg-1時其CAT活性為對照的2.6倍,差異極顯著(P<0.01)。高羊茅的CAT活性在Cd2+濃度為500 mg·kg-1時較對照降低54%,差異極顯著(圖1C,P<0.01),在Cd2+濃度為1 000 mg·kg-1時其CAT活性較對照升高94%,其差異達極顯著水平(P<0.01)。黑麥草的CAT活性隨著Cd2+濃度增加呈先升后降趨勢,在Cd2+濃度為500和1 000 mg·kg-1時分別為對照的3.1倍和3.3倍,其差異極顯著(圖1C,P<0.01),當Cd2+濃度為200和2 000 mg·kg-1時差異并不顯著,但均高于對照。

不同濃度Cd2+脅迫均會增加白三葉、高羊茅和黑麥草的MDA含量(圖1D)。白三葉的MDA含量在Cd2+濃度200～1 000 mg·kg-1時其MDA含量為對照的5.6～6.3倍,其差異達到極顯著水平(P<0.01)。高羊茅的MDA含量在Cd2+濃度為1 000～2 000 mg·kg-1時較對照顯著上升28%～29%(P<0.05)。黑麥草的MDA含量在Cd2+濃度500～2000 mg·kg-1時與對照相比升高68%～108%,其差異極顯著(P<0.01)。

2.3 Cd2+脅迫對草坪草葉片超微結構的影響

2.3.1Cd2+脅迫對白三葉葉片細胞超微結構的影響 白三葉葉肉細胞的各細胞器結構在對照中清晰(圖2A,D,G,J,M);當Cd2+濃度為500 mg·kg-1時葉肉細胞中各細胞器沒有出現變化(圖2B,E,H,K,N);當Cd2+濃度為1 000 mg·kg-1時,葉綠體發生聚集、數量減少、形狀變圓(圖2C),葉綠體膜發生不同程度的溶解,葉綠體內部基粒片層結構混亂、排列不整齊、部分變為條紋狀,質間片層空間變小、出現輕微質壁分離、部分溶解現象(圖2F)。

圖2 不同濃度Cd2+處理對白三葉葉片超微結構的影響

2.3.2Cd2+脅迫對高羊茅葉片細胞超微結構的影響 在對照中,高羊茅葉肉細胞的細胞壁、細胞核、液泡、葉綠體等細胞器結構清晰,葉綠體的形狀為橄欖形或橢圓形,內部基粒片層結構明顯且排列整齊、淀粉粒清晰可見(圖3A,D,G,J,M)。在Cd2+濃度為500 mg·kg-1的處理下葉肉細胞沒有出現變化(圖3B,E,H,K,N);在Cd2+濃度2 000 mg·kg-1時,葉綠體發生聚集、數量減少(圖3C),內部基粒片層結構被破壞,部分發生溶解斷裂(圖3F),細胞核內染色質發生輕微凝聚(圖3L),細胞壁發生輕微質壁分離(圖3O)。

圖3 不同濃度Cd2+處理對高羊茅葉片超微結構的影響

2.3.3Cd2+脅迫對黑麥草葉片細胞超微結構的影響 黑麥草在對照中葉肉細胞的各細胞器結構清晰,葉綠體為橢圓形,內部基粒片層結構排列整齊、大部分為矩形、基粒類囊體片層垛疊緊密;當Cd2+濃度為500 mg·kg-1時其葉肉細胞內各細胞器沒有出現變化(圖4B,E,H,K,N);在Cd2+濃度為2 000 mg·kg-1時,葉綠體數量減少,發生聚集(圖5C),內部片層結構模糊,基粒片層排列混亂且片層結構出現輕微溶解現象(圖4F),細胞核內染色質略微凝聚(圖4L),葉綠體和細胞壁的質壁分離現象明顯,細胞壁輕微皺縮,液泡略微縮小(圖4O)。

3 討論

重金屬脅迫對植物光合色素含量和葉綠體結構的影響,直接影響其生長發育及形態功能。造成葉綠素含量降低有兩個原因,一是Cd與植物細胞中葉綠素合成酶相互作用,影響葉綠素前體合成,加快葉綠素分解[22];二是Cd破壞葉肉細胞內各細胞器的結構功能,從而降低葉綠素合成酶的活性[23]。本研究表明白三葉、高羊茅和黑麥草的葉綠素含量隨Cd2+濃度增加而下降,與Huang等[24]在鎘對高羊茅光合活性的研究結果一致。高濃度Cd2+脅迫降低高羊茅葉綠素含量,影響高羊茅正常生長。類胡蘿卜素是重要的光合輔助色素,通過控制能量消耗和清除植物體內的自由基來避免蛋白質和葉綠素受到損傷[25],高濃度Cd2+脅迫下植物體內產生大量的自由基[26],超出抗氧化酶的清除能力,將會影響類胡蘿卜素合成。本研究中3種草坪草的類胡蘿卜素含量隨著Cd2+濃度增加而降低的結論,與董春燕[27]以三葉草(Trifoliumpretense)為實驗材料的研究結果類似,當鎘濃度為3.5 mmol·L-1時類胡蘿卜素含量較對照降低77.37%。

植物在逆境條件下會產生電子還原產物活性氧,其中包括超氧陰離子、過氧化氫等[28]。SOD酶能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫,POD酶的活性相對較高,CAT酶則能夠催化過氧化氫分解成氧和水[29]。本研究中3種草坪草在鎘脅迫下SOD和POD活性總體呈升高趨勢,與Lou等[30]發現在Cd脅迫下高羊茅SOD和POD活性增加,以保護植物免受重金屬誘導的氧化損傷的研究結論一致。抗氧化酶活性增加可將草坪草體內過多的活性氧自由基轉化為毒害較低或無害物質,平衡活性氧含量,激活草坪草自身保護機制[6]。但是,當重金屬濃度過高草坪草積累過量活性氧使細胞內蛋白質、核酸、色素和酶等受到氧化損傷[31],本研究中3種草坪草CAT活性隨著Cd2+濃度增加呈先升后降趨勢。韓寶賀等[32]研究結果中也有相同趨勢,低濃度Cd2+脅迫下,白三葉升高CAT活性來防止活性氧造成的毒害,但在Cd2+濃度300 μmol·L-1時,植物體內的氧化平衡被打破,其CAT活性急劇下降。MDA含量通常用于判斷植物細胞膜的損傷程度[33],其含量越高則表明對植物細胞膜的損傷越嚴重[34]。本研究中不同濃度的Cd2+脅迫均會增加草坪草的MDA含量,這與凌宇等[6]研究結果一致,在低、高濃度Cd2+脅迫下高羊茅和匍匐翦股穎(Agrostisstolonifera)MDA含量均高于對照。

植物細胞的超微結構變化規律是判斷其抗逆能力的重要指標之一[33]。植物受到鎘脅迫后其葉肉細胞內各細胞器的損傷主要體現在葉綠體、基粒片層、細胞壁、線粒體和細胞核等發生異常變化[24]。低濃度的Cd2+脅迫對草坪草葉片葉肉細胞超微結構的影響不明顯,Cd2+濃度越高其各細胞器結構損傷越嚴重,主要表現為細胞壁發生質壁分離,葉綠體發生聚集、數量減少、形狀改變、內部基粒片層結構被破壞。孫圓圓等[35]在鎘脅迫對多花黑麥草(Loliummultiflorum)葉片超微結構的研究中也得出相似結論,高濃度Cd脅迫對多花黑麥草葉肉細胞超微結構有所損傷,部分葉綠體基粒片層溶解。綜上,草坪草受到高濃度的Cd2+脅迫后產生過多的活性氧自由基,其體內將分泌大量的抗氧化酶來消除有害物質,超出抗氧化酶的清除能力,將引起膜脂過氧化反應從而產生大量的MDA,損傷草坪草細胞膜的結構,使其發生質壁分離,破壞葉綠體結構,進而降低光合色素含量,抑制光合作用,毒害草坪草的生理生化,最終影響草坪草進行正常的生命活動。

4 結論

隨著Cd2+濃度增加,3種草坪草的生理損傷愈發嚴重,其光合色素含量不斷減少,MDA含量逐漸增加,SOD和POD活性總體上為上升趨勢,CAT活性呈先升后降趨勢。其中,Cd2+濃度為2 000 mg·kg-1時,白三葉無法存活,高羊茅和黑麥草葉肉細胞內的細胞膜和各細胞器均受到不同程度的破壞,高羊茅葉綠體損傷更嚴重。因此,黑麥草的耐受能力高于高羊茅和白三葉,建議在鎘污染較重的土壤選用高羊茅和黑麥草,鎘污染較輕的土壤選用白三葉。