川西北高原短芒型老芒麥種質形態變異及遺傳親緣關系分析

余靜菠, 陳仕勇, 桑杰多吉, 張昌兵, 葉 莉, 姬文琴, 李 進

(1.西南民族大學青藏高原研究院, 四川 成都 610041; 2.西南民族大學畜牧獸醫學院, 四川 成都 610041;3.四川省阿壩州林業和草原局, 四川 馬爾康 62400; 4.四川省草原科學研究院, 四川 成都 611731)

老芒麥(ElymussibiricusL.)又稱西伯利亞披堿草,是禾本科披堿草屬中一種多年生異源四倍體牧草(2n=4x=28),含有St和H基因組[1]。它主要分布在我國的北方和青藏高原地區,是我國高寒牧草的代表種之一;具有產量高、營養價值高、抗逆性強等特點,被廣泛應用于天然草場改良和人工草場建設,在青藏高原畜牧業和生態工程中發揮著重要作用[2]。

在自然進化的過程中植物身處于不斷改變的環境,植物為了提高自身的生存能力,會進化出特定的器官來應對這些變化,例如在外稃頂端形成的芒[3]。芒是幼穗外稃延伸出的堅硬、長針狀結構。在自然條件下,芒作為谷物上堅硬的部分,能掛在野生動物的皮毛上,有助于野生種質的種子散布和掩埋,同時能防止蟲害以及鳥害[4-5]。但在畜牧業生產中長芒會造成不好的影響,有研究表明長芒對牧草的適口性和動物的營養需求有負面影響[6]。長芒降低了植物中的可消化營養物質,并且家畜在食用過程中可能會刺激胃并產生疼痛[7]。此外,長芒會妨礙收獲后的處理、儲存和加工活動,在生產應用中往往需要進行斷芒或去芒處理,為生產者帶來諸多不便[8],所以開展老芒麥短芒種質的篩選和利用具有重要的意義。因此我們需要合理利用野生老芒麥進行短芒型品種的培育,而國內豐富的野生老芒麥資源,也為短芒型種質的篩選和評價提供了便利的條件。

目前,前人對于禾本科植物中芒的調控機理的研究已有一定進展。水稻中通過遺傳分析確定了幾個與芒的形成和伸長有關的基因,如調控芒形成的An-1和LABA1(An-2)、調控芒伸長的SLP1,DL(OsYABBY),OsETTIN2(OsARF2)RAE2和YABBY基因家族的Tob1(TONGARIBOUSHI1)[9-11]。大麥中,在早期Muller等[12]發現同源異型盒基因Knox3產生的帶帽結構,會致使異位分生組織在外稃上發育,從而不能形成正常的芒。大麥中抑制芒伸長的基因Lks2位于7H染色體上,編碼SHORTINTERNODES(SHI)家族轉錄因子[13]。本研究以在川西北高原收集的24份短芒型老芒麥種質為研究材料,以老芒麥品種‘川草2號’和野生老芒麥‘Esxz’為對照,通過對短芒型老芒麥農藝性狀和基于目標起始密碼子多態性(Start codon targeted polymorphism,SCoT)分子標記的遺傳多樣性評價,以期為短芒型老芒麥的育種等資源創制工作提供重要的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究共選用了26份老芒麥種質資源,其中24份為聯合攻關課題組前期在四川紅原地區經過多年評價篩選出的短芒型老芒麥種質資源,同時選用1份國審品種‘川草2號’及1份采集于西藏的野生老芒材料麥(‘Esxz’)為對照(表1)。

表1 材料編號及名稱

1.2 試驗地概況

試驗地設置在四川省草原科學研究院牧草育種基地,基地位于阿壩藏羌自治州紅原縣境內,紅原縣海拔3 504 m,年均溫為1.1℃,年降水量為744 mm,氣候為大陸性高原寒溫帶季風氣候,無絕對無霜期。冬季嚴寒,夏季涼爽春秋短,日照充足,晝夜溫差大。試驗地土壤為高山甸草土,pH值約為6.6。

1.3 研究方法

1.3.1形態指標測定 每份材料隨機采集10個長勢一致的單株進行測定,測定指標分為數量性狀和質量性狀,其中質量性狀通過觀察評分。本研究選取了5個質量性狀,評分等級如下。

花序顏色:0——青色,1——紫紅色,2——紫綠色,3——淺紅色。葉片植株被粉:0——無粉,1——有粉。基生葉鞘被毛:0——無毛,1——少毛,2——多毛。桿生葉片被毛:0——無毛,1——少毛,2——多毛。葉片顏色:0——綠,1——藍綠,2——黃綠。

50個數量性狀于乳熟期(Milk stage,MS)測定,花序、小穗、稃片和穎片分別在上、中、底部測量(上部為距離頂端1/3處,中部為距離頂端1/3～2/3處,底端為距離2/3至最遠處)。

莖稈性狀有:株高(Plant height)、莖長(Stem length)、莖節數(Number of stem nodes)、莖粗(Stem diameter)。

葉片性狀有:旗葉葉長(Flag leaf length)、旗葉葉寬(Flag leaf width)、倒二葉葉長(Penultimate leaf length)、倒二葉葉寬(Penultimate leaf width)。

花序性狀有:花序小穗數(Panicle number of inflorescence),上、中、底部的花序小穗數(Panicle number of inflorescence),花序節數(Number of inflorescence nodes)。

穗部性狀有:上、中、底部的穗節小穗長(Panicle length of inflorescence)、節間長(Internode Length of inflorescence)及小穗小花數(Floret number of inflorescence)。

穎片性狀有:上、中、底部的第一穎長(First glume length)、第一穎寬(First glume width)、第一穎芒長(First awn length of glume)、第二穎長(Second glume length)、第二穎寬(Second glume width)、第二穎芒長(Second awn length of glume)。

稃片性狀:上、中、底部的外稃長(Lemma length)、外稃寬(Lemma width)、內稃長(Palea length)、內稃寬(Palea width)。每份材料隨機采集10個長勢一致的單株,用卷尺、直尺和游標卡尺進行測定。

1.3.2DNA提取 每份材料隨機選取10株單株葉片進行混合。采用植物DNA提取試劑盒DP305(北京天根生化科技有限公司)提取材料DNA,通過nanodrop測定其濃度與純度,并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性,根據檢測結果將DNA稀釋至10 ng·μL-1后,于-20℃冰箱待用。

1.3.3引物篩選及SCoT-PCR擴增 本研究選用Collard等[14](SCoT1～SCoT36)及Luo等[15](SCoT37～SCoT80)報道的SCoT引物,引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。選取8份材料對總共80個SCoT引物進行引物的多態性篩選,共篩選出14對引物。根據擴增條帶多態性,條帶清晰度來確定對應退火溫度。

PCR擴增總體積為15 μL,其中包括:6 μL模板DNA(10 ng·μL-1)、1.5 μL引物(10 μmol·L-1擎科生物技術,北京,中國)、7.5 μLMix預混液(Es Taq DNA Polymerase,Mg2+,dNTPs以及PCR穩定劑和增強劑組成的預混體系)(天根生化科技,北京,中國)。PCR擴增反應在BIO-RAD T100 Termal Cycler PCR儀上進行,擴增程序為:94℃變性3 min;然后進行36個循環的94℃變性1 min,48℃～55℃梯度退火1分鐘,72℃延伸2 min;最后在72℃下延伸5 min。待PCR程序結束后,在1倍的TAE緩沖溶液中用1.2%瓊脂糖凝膠電泳,通過凝膠成像系統來觀察擴增的結果并保存。

1.4 數據處理

形態觀察的數據處理與分析在SPSS 26.0進行,對形態指標的遺傳多樣性評價用變異系數、Shannon-Wiener’s多樣性指數,同時進行單因素方差分析。分別對50個數量性狀進行等級劃分,根據性狀平均數(x)和標準差(s)將其劃分為10個等級,1級≤x-2 s,10 級>x+2 s,中間每級間差0.5 s,利用SPSS軟件基于各形態指標的平均數計算供試材料間的歐氏遺傳距離并進行UPGMA聚類分析了解各種質之間的親疏關系;對質量性狀進行賦值,按照公式H=-∑PilnPi來計算Shannon-Weaver’s遺傳多樣性。

對SCoT標記結果,選取條帶清晰且多態性好的引物進行統計,在相同遷移位置上,有帶記為1,無帶記為0,建立1,0矩陣。通過軟件POPGENE 1.32中計算多態性條帶百分比(Percentage of polymorphic bands,PPB)、有效等位基因數(Ne)、Nei’ s基因多樣性指數(H)和Shannon’s多樣性指數(I)。通過NTSYS-pc 2.10e軟件計算種質間的遺傳相似性系數(Genetic similarity coefficients,GS),并利用非加權組平均法(Unweighted pair group method with arithmetic average,UPGMA)進行聚類分析。利用軟件Structure 2.3.4分析老芒麥材料的群體結構和ΔK來確定最優分群數K,最終構建群體結構圖[16]。

2 結果與分析

2.1 老芒麥形態指標的變異分析

2.1.1質量性狀 對26份老芒麥5個質量性狀進行遺傳多樣性分析結果如表1所示,結果表明,花序顏色遺傳多樣性指數最高,為 1.24,基生葉鞘被毛遺傳多樣性為0.72,葉片植株被粉為0.63,葉片顏色為0.49,桿生葉被毛為0.56。由表可知,在5個質量性狀中,遺傳多樣性指數大小為花序顏色>基生葉鞘被毛>葉片植株被粉>桿生葉被毛>葉片顏色(表2)。

表2 老芒麥5個質量性狀的遺傳多樣性

2.1.2數量性狀 對26份老芒麥種質50個數量性狀的分析表明(表3),每份材料各性狀存在較大的變異。除花序中部穗節小穗數、花序底部穗節小穗數、上部稃片外稃長、上部稃片內稃長、中部稃片外稃長、中部稃片內稃長、下部稃片外稃長外,其余的性狀的變異系數都大于10%,性狀變異系數的范圍為4.62%～45.93%,平均值為19.97%。其中,變異系數在30%以上的性狀有9個分別為:上部穎片第二穎寬(33.10%),上部穎片第一穎芒長(33.66%),上部稃片外稃芒長(36.70%),中部穎片第二穎芒長(37.16%),下部穎片第一穎芒長(37.67%),下部穎片第二穎芒長(37.92%),上部穎片第二穎芒長(39.69%),中部穎片第一穎芒長(40.08%),花序上部穗節小穗長(45.93%),可見26份老芒麥種質變異主要來自于這9個性狀。數量性狀多樣性指數的平均值約為1.80,其中農藝性狀的遺傳多樣性指數最高是莖長(2.01),最低的是花序底部穗節小穗數(0.66)。

表3 老芒麥 50 個數量性狀的遺傳多樣性分析

對材料間外稃芒長進行分析(圖1),外稃芒長平均值‘Esxz’最大,材料8最小,將供試材料分為5個差異顯著的組合(P<0.05),其中‘川草2號’及‘Esxz’外稃芒長平均值顯著大于本研究24份短芒型老芒麥外稃芒長(P<0.05),且8,24,26這三份材料外稃芒長平均值小于其他材料(P<0.05)。表明供試的老芒麥種質具有芒短的穩定形態特性。

圖1 26份材料外稃芒長的形態學特征

2.1.3基于農藝性狀的聚類分析 聚類分析是研究種質資源分類的有效方法之一,性狀越多,越能體現其實際情況,從而避免了僅以個別性狀進行經驗性分類的弊端。依據50個數量性狀對26份種質材料進行聚類分析,可將供試種質分為五大類(圖2)。類群Ⅰ包括7份材料,材料編號分別為21,15,9,13,5,20,12,占26.92%,在形態學上表現為,植株高大,花序節數多,穗長。類群Ⅱ包括4份材料,材料編號為11,7,19,17,占15.38%,在形態學上表現為,稃片和穎片發達。類群Ⅲ包括5份材料,材料編號為14,10,25,2,23,占3.846 %,在形態學上表現為植株莖稈粗、葉片長且寬、小穗數多,產量相關性狀優越。類群Ⅳ包括5份材料,編號分別為26,8,4,1,24,占23.08%,在形態學上表現為內外穎、外稃長、芒長都是5個類群中最短,可以作為選育短芒型老芒麥的目標親本加以利用。類群Ⅴ包括6,3,22,18,16,在形態學上表現為植株矮小。

圖2 26份材料的聚類分析

2.2 基于SCoT標記評價老芒麥種質遺傳多樣性

2.2.1SCoT引物多態性分析 利用14個SCoT引物共擴增出142條清晰條帶,平均每個引物擴增10.1條,變幅為8條(SCoT7)～ 12條(SCoT38);多態性條帶共96條,平均每個引物擴增多態性條帶為6.9條,變幅為3(SCoT60)～10條(SCoT10),多態性比率(PPB)為67.61%;Ne變異范圍為1.306～1.661,平均為1.498;H范圍在0.165～0.325之間,平均為0.274;I范圍在0.237～0.500之間,平均為0.397。這說明了SCoT標記對老芒麥具有良好的通用性與多態性,能夠用于老芒麥種質的遺傳變異分析(表4)。

表4 14個SCoT引物擴增結果

2.2.2聚類分析 基于DICE遺傳相似系數構建了各供試老芒麥種質的UPGMA聚類樹狀圖。如圖3,在遺傳相似系數為0.74處大致可將所有種質劃分為3個類群,其中類群Ⅰ中包括材料26,3,13等,表明類群Ⅱ中的材料和審定品種‘川草2號’親緣關系非常近;類群Ⅱ中包括材料7,6,5等材料;材料‘Esxz’與其他種質老芒麥的遺傳距離最遠,單獨聚為第Ⅲ類。

圖3 SCoT標記對26份老芒麥種質親緣關系聚類圖

2.2.3群體結構分析 根據Structure Harvester網頁的分析結果表明,供試材料被劃分為2個類群(K=2),分別標記為Q1,Q2并利用Structure繪制26份老芒麥種質的群體結構圖(圖4)。本研究參照劉麗華等[17]的劃分方法,當Q≥0.6表明材料血緣相對單一,Q<0.6則具有混合來源。Q1類群(Q<0.6)中有17份材料,65%的材料擁有混合來源,遺傳背景復雜;Q2類群(Q值>0.6)中有9份材料,表明材料來源單一,遺傳背景簡單,與其他類群基因交流較少。Q2類群(0.18)芒長平均數小于Q1類群(0.19),但Q2類群(3.50)芒長變異系數大于Q1類群(2.93);Q2類群(0.14)小穗平均數小于Q1類群(0.16),且Q2類群小穗數變異系數(48.69)小于Q1類群(49.69)。

圖4 26份老芒麥材料群體結構分析

3 討論

植物表型性狀是其外部形態特征的綜合體,能夠直觀的表現其遺傳多樣性。植物在適應和進化的過程中會產生表型性狀的變異,增加群體表型的多樣性。變異系數的大小與群體表型多樣性豐富度呈正相關關系[18]。通過對植物表型性狀的分析研究,能夠在短時間內了解植物的遺傳變異情況[19]。本研究將26份老芒麥種植于同一地點,使其生在相同的生境下,消除環境不同帶來的影響。對24份野生短芒型老芒麥55個形態指標進行表型性狀多樣性研究結果表明,供試的種質具有豐富的形態學變異水平,質量性狀的多樣性指數在群體間的變化范圍為0.49～1.24,數量性狀的多樣性指數在群體間的變化范圍為0.66～2.01,表明供試老芒麥的數量性狀比質量性狀存在更大的變異,這與尹婷婷等[20]在老芒麥遺傳多樣性分析中的結果一致。鄢家俊等[21]在對野生老芒麥居群穗部形態數據的研究中發現,13個野生老芒麥的居群的芒長均大于1 cm,和本研究中兩份對照老芒麥測量數據一致,供試短芒型老芒麥的外稃芒長均值為0.604 cm,這一性狀顯著小于兩份對照材料,為短芒型老芒麥新品種的選育提供幫助。研究得到26份材料的數量性狀變異系數的范圍為4.62%～45.93%,相比于李瑤等[22]對59份老芒麥的研究變異系數更大,可能是本研究所測定形態指標數量更多,產生了更豐富的形態多樣性,其中以中部穎片第一穎芒長、花序上部穗節小穗長最為突出,與芒相關性狀的變異系數也較大。表明材料中芒長的可塑性強,對于已收集到的老芒麥材料應根據其不同的特性加以利用,通過雜交育種和合理的栽培管理措施能達到理想的選擇效果。

遺傳多樣性是種質資源研究中的重要內容,本研究嘗試使用SCoT分子標記,該標記比簡單序列重復標記(Simple sequence repeat,SSR)、DNA擴增片段長度多態性(Amplified fragment length polymorphism,AFLP)、內部簡單重復序列(Inter-simple sequence repeats,ISSR)成本低、多態性好,重復性高于隨機片段多態性標記(Random amplified polymorphic DNA,RAPD)、相關序列擴增多態性標記(Sequence-related amplified polymorphism,SRAP)[23-24]。本研究的結果表明,SCoT標記可以有效地評估老芒麥種質的遺傳多樣性,該標記的多樣性數據高于之前報道的SRAP(I=0.2267,H=0.1508)[25],SSR(I=0.1930,H=0.1296)[25],ISSR(I=0.269,H=0.181)[26]和RAPD(I=0.263,H=0.176)[27]。說明SCoT引物對老芒麥種質具有好的擴增效果,能在野生老芒麥種質中檢測出較豐富的遺傳多態性,將其用于短芒型老芒麥種質資源種質鑒定、遺傳多樣性分析等研究是可行的。群體結構分析可以用于評價野生老芒麥種質的遺傳背景與親緣關系,對老芒麥雜交育種中的親本選配具有重要的指導作用。群體遺傳結構分析表明,65%的老芒麥種質資源擁有混合來源,同一地區和類群間的野生老芒麥資源基因間存在著較為廣泛的交流。將綜合本研究中形態指標對應群體結構來討論發現,Q1類群芒短且Q1類群產量相關性狀更高,與Ntakirutimana等[28]研究結果一致,即芒長的增加導致每單株小花數減少,芒長與種子產量相互影響的結論一致,因此芒長這一性狀是影響種子產量的重要因素之一,短芒型材料的選育是高產育種的目標親本。

使用形態標記對種質資源進行研究長久以來是最有效的途徑之一,但環境因素及遺傳因素制約著表型性狀的表達,具有一定的局限性。然而,消除環境變異的情況下,基于表型性狀的聚類和基于SCoT標記的聚類不能完全對應,造成這一結果的原因可能是:(1)表型性狀的檢測水平有限,且植株生存環境的細微環境也會對其表型造成影響[29];(2)本研究所選SCoT引物不能將整個基因組的變異情況揭示完全,且有些發生在DNA水平的變異和表型性狀的改變沒有因果關系。盡管如此,本研究通過結合表型性狀與基因型變異分析,為其種質資源提供綜合性評價,對加強短芒型老芒麥材料選育提供基礎。

4 結論

本研究采用形態學和SCoT分子標記揭示了供試的短芒型老芒麥種質具有豐富的遺傳變異;其中材料Esdm24,Esdm6,Esdm22這3份種質的芒長及芒相關性狀較為優異,可以作為短芒型老芒麥新種質創制和品種選育的優異種質。