‘黑比諾’、‘馬瑟蘭’和‘北紅’葡萄酚類物質差異研究

李光宗,馬軍,雷昊,單守明

(寧夏大學 農學院,寧夏 銀川,750021)

酚類物質是植物生長發育過程中產生的重要次級代謝物,在植物抵抗生物和非生物脅迫中發揮重要作用。葡萄果實中的酚類物質主要分布于果皮和種子中,可以分為花色苷和非花色苷兩大類,非花色苷類酚主要包括黃烷醇、黃酮醇、酚酸和芪類物質。其中,黃烷醇是賦予葡萄和葡萄酒苦味和收斂感的主要物質;黃酮醇和酚酸作為輔色物質,對葡萄和葡萄酒的顏色具有重要作用[1];而芪類物質尤以白藜蘆醇,具有抗炎、抗氧化和抗癌等對健康有益的作用[2]。葡萄中的酚類物質以浸漬的方式進入葡萄酒中,是葡萄酒的重要組成部分,其含量和比例對葡萄酒的品質具有重要作用[3-4]。

葡萄果實酚類物質的成分和含量受品種、果實成熟度、氣候、土壤條件和栽培措施等多方面因素影響[5-8]。品種作為影響酚類物質合成的內部因素,是造成葡萄果實中酚類物質含量差異的主要原因[9-10]。張娟等[11]研究發現,‘馬瑟蘭’和‘赤霞珠’等品種具有較高的酚類物質,而‘蛇龍珠’和‘黑虎香’等品種的酚類物質含量較低;XIA等[12]研究表明,東方品種葡萄果皮酚類物質含量高于歐亞種。‘黑比諾’為傳統釀酒世界名種,所釀酒細膩質優[13],是寧夏產區主栽品種之一;‘馬瑟蘭’為釀酒葡萄新品種,2013年引進寧夏產區,其綜合品質符合釀造優質紅葡萄酒的要求[14],是寧夏釀酒品種的潛力股;‘北紅’為高抗寒抗病品種,于2011年引進寧夏產區,其能夠很好的適應寧夏氣候,綜合性狀優良。因此研究3個品種酚類物質含量差異對產區優良品種篩選具有重要意義。近年來,國內外對于葡萄酚類物質的研究多集中于成熟期花色苷類酚的研究,而對于成熟過程中非花色苷類酚的研究較少,對于非花色苷類酚單體成分、合成積累規律的研究更鮮有報道。

基于此,以‘黑比諾’、‘馬瑟蘭’和‘北紅’為試材,研究其非花色苷類酚的積累規律,以期確定和比較各品種非花色苷酚類物質特性差異,為釀酒葡萄品種篩選和葡萄酒品質提升提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與材料

本研究于2021年在寧夏銀川平吉堡“寧夏現代農業綜合開發工程技術研究”釀酒葡萄示范園進行(38°24′ N,106°01′ E),試驗地位于銀川平原引黃灌區中部,海拔1 120 m,年降水量180～200 mm,無霜期160 d左右,沙質土壤。供試材料為3種紅色釀酒葡萄品種(表1),其均為7年生,“廠”式架形,栽培方式為南北行向,株行距1.0 m×3.0 m,樹勢基本一致,葡萄園水肥管理一致。

表1 供試品種Table 1 Test varieties

氫氧化鈉、碳酸鈉、醋酸鈉、乙醇、福林酚等(均為分析純),銀川偉博鑫生物科技有限公司;兒茶素、表沒食子兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、S-圣草酚、蘆丁、楊梅素、芹菜苷、槲皮苷、柚皮素、香草酸、原兒茶酸、2,5-二羥基苯甲酸、水楊酸、沒食子酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、肉桂酸、白藜蘆醇標準品(均為色譜純),美國Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間試驗設計

于2021年7月14日選取長勢一致的葡萄植株(各品種30株),每株葡萄樹體陰陽面各選擇1串葡萄果穗,共計60串,用標簽牌做好標記。分別在2021年8月6日(轉色初期,D1)、2021年8月21日(轉色盛期,D2)、2021年9月2日(成熟期,D3)、2021年9月23日(采收期,D4)取樣,每次從標記好的果穗上、中、下部位采集果粒,各品種共計180粒,混勻后,液氮速凍,存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 葡萄果實酚類品質指標測定

采用福林-丹尼斯法測定總單寧含量;福林酚試劑比色法測定總酚含量,結果以沒食子酸記;pH示差法測定總花色苷含量,結果表示為矢車菊素-3-葡萄糖苷。

1.2.3 葡萄果實單體酚含量測定

果實單體酚的提取參照劉迪迪等[3]的方法略作修改。稱取2.0 g葡萄粉末,加入提取液(5 mL蒸餾水和45 mL乙酸乙酯),置于搖床(30 ℃、170 r/min)避光提取30 min,重復3次,收集上清液于茄形瓶中,用旋轉蒸發儀蒸干(33 ℃),殘渣用2 mL色譜甲醇溶洗,用0.45 μm的濾膜過濾后備用。全程避光操作,每個樣品3個生物重復。色譜分析:使用LC-20A島津超快速液相色譜儀配有SPD二極管陣列檢測器對樣品進行定性定量檢測,色譜條件為280 nm,柱溫30 ℃,進樣量5 μL。流動相A:5%甲醇+0.1%甲酸+水,流動相B:5%乙腈+0.1%甲酸+甲醇,流速為1.0 mL/min。洗脫程序:0～8 min,10% B;8～30 min,10%～30% B;30～35 min,30% B;35～45 min,30%～40% B,45～50 min,40%～50% B;50～52 min,50%～100% B;52～54 min,100% B;54 min,100%～10% B;54～60 min,10% B。根據標準品的保留時間定性單體酚成分,標準曲線進行定量,含量以鮮重(fresh weight,FW)計,表示為mg/kg FW。

1.3 數據分析

采用Excel 2021整理數據,SPSS 26.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA),最小顯著差數法(least significant difference, LSD)進行多重比較(P<0.05差異顯著),結果表示為平均值±標準偏差,使用Origin 2021和SIMCA軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同品種葡萄果實中總酚、總單寧和總花色苷含量分析

由表2可知,PN和MS總酚含量均在轉色盛期達到最大值,之后逐漸下降,而BH在轉色盛期含量最低,之后逐漸升高,除采收期外,PN葡萄總酚含量均顯著高于MS和BH,采收時,PN、MS和BH的總酚含量分別為8.22、7.68、8.39 mg/g。PN和BH總單寧含量變化與總酚一致,而MS隨果實成熟呈下降趨勢,與總酚變化有所差異,采收時,BH葡萄總單寧含量顯著高于PN和MS,含量分別為5.85、3.47、2.21 mg/g。3個品種總花色苷含量均隨果實成熟不斷上升,采收時含量表現為MS>BH>PN。

表2 果實總酚、總單寧和總花色苷含量變化 單位:mg/g FWTable 2 Content changes of total phenols, total tannins, and total anthocyanins in grapes

2.2 不同品種葡萄果實中非花色苷類酚定性分析

本研究使用超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography, UPLC)分析葡萄果實中的非花色苷類酚。由圖1-a可知,在此色譜條件下,22種非花色苷類酚的標準品可得到較好的分離。不同標準品中沒食子酸極性最強,最先出峰;芹菜苷極性最弱,最后出峰。由圖1-b～圖1-d可知,除槲皮苷和柚皮素分別在MS和BH中未檢出外,其他非花色苷類酚均有檢出,且目標峰與標品的保留時間一致,在此色譜條件下3個品種樣品中的非花色苷酚類物質得到較好的分離。

1-沒食子酸;2-原兒茶酸;3-表沒食子兒茶素;4-兒茶素;5-2,5-二羥基苯甲酸;6-表沒食子兒茶素沒食子酸酯;7-香草酸;8-表兒茶素;9-丁香酸;10-沒食子兒茶素沒食子酸酯;11-表兒茶素沒食子酸酯;12-阿魏酸;13-對香豆酸;14-水楊酸;15-蘆丁;16-白藜蘆醇;17-楊梅素;18-槲皮苷;19-S-圣草酚;20-肉桂酸;21-柚皮素;22-芹菜苷a-22種單體酚標準品的UPLC色譜圖;b-采收期‘黑比諾’葡萄液相檢測圖譜;c-采收期‘北紅’葡萄液相檢測圖譜;d-采收期‘馬瑟蘭’葡萄液相檢測圖譜圖1 單體酚標準品及樣品UPLC色譜圖Fig.1 UPLC chromatogram of monomeric phenolic standards and samples

2.3 不同品種葡萄果實中黃烷醇類酚含量分析

如圖2-a所示,3個品種果實中共檢測出6種黃烷醇類酚,其中兒茶素為主要成分,其含量隨果實成熟呈先上升后下降的趨勢,采收時分別占PN、MS和BH黃烷醇總含量的95.54%、91.12%和92.32%,PN采收時兒茶素含量為678.90 mg/kg,顯著高于MS和BH,分別是MS和BH的2.91和3.11倍。由圖2-a還可看出,相較于兒茶素,其他黃烷醇類酚含量明顯較低,其中表兒茶素沒食子酸酯在PN葡萄成熟過程中均顯著低于BH和MS,采收時其含量僅為0.58 mg/kg。

a-黃烷醇類酚含量變化分布圖;b-黃烷醇總含量變化分布圖圖2 果實黃烷醇含量變化Fig.2 Content changes of flavanols in grapes注:FO1～FO6分別代表兒茶素、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素;同時期不同小寫字母表示品種間差異顯著(P<0.05),未標字母表示差異不顯著(下同)。

由圖2-b可知,3個品種果實中黃烷醇總含量隨果實成熟呈先上升后下降的趨勢,轉色初期,3個品種黃烷醇類酚含量較低,但此后至果實采收時,PN均顯著高于MS和BH,采收時表現為PN>MS>BH,PN中黃烷醇總含量為710.62 mg/kg,分別較MS和BH高63.97%和66.77%。PN葡萄中,無色花青素和花翠素作為前體物質,大量轉化為兒茶素和表沒食子兒茶素,造就其黃烷醇含量明顯高于MS和BH,從而更利于黃烷醇類酚的積累。

2.4 不同品種葡萄果實中黃酮醇類酚含量分析

如圖3-a所示,共檢測出6種黃酮醇類酚,在PN與BH葡萄果實中,蘆丁為主要成分,其含量隨果實成熟逐漸增加,采收時含量分別為12.45 mg/kg和16.11 mg/kg,占黃酮醇總含量的69.10%和54.38%;MS葡萄中,S-圣草酚和楊梅素含量在各時期均顯著高于PN和BH,S-圣草酚為主要成分,采收時含量達到27.91 mg/kg,占黃酮醇總含量的49.38%。同時,MS各時期均未檢測到槲皮苷,而BH各時期未檢測到柚皮素。

a-黃酮醇類酚含量變化分布圖;b-黃酮醇總含量變化分布圖圖3 果實黃酮醇含量變化Fig.3 Content changes of flavonols in grapes注:FA1～FA6分別代表S-圣草酚、蘆丁、楊梅素、芹菜苷、槲皮苷和柚皮素(下同)。

由圖3-b可知,隨著果實成熟,3個品種黃酮醇總含量呈上升趨勢,PN和BH在成熟過程中黃酮醇總量均顯著低于MS,于采收時達到最大值(18.01 mg/kg和29.62 mg/kg),而MS高達56.52 mg/kg,分別是BH和PN的1.91和3.13倍。柚皮素是黃酮醇代謝的重要前體物質,其可能作為底物大量用于合成其他酚類物質,這種作用在BH中更為明顯;MS葡萄中,S-圣草酚和楊梅素競爭優勢強于PN和BH,因此其黃酮醇含量更高,而在BH和PN中,相較于槲皮苷,蘆丁更具有競爭優勢,槲皮素作為底物多數用于蘆丁合成。

2.5 不同品種葡萄果實中酚酸類酚含量分析

2.5.1 羥基苯甲酸

如圖4-a所示,共檢測出6種羥基苯甲酸類酚,3個品種中香草酸為主要成分,隨著果實成熟,其在PN中表現出先上升后下降的趨勢,而在MS和BH中呈現不同的變化趨勢,采收時,BH中香草酸含量顯著高于PN和MS,分別占羥基苯甲酸總含量的77.23%、81.01%和74.14%。

由圖4-b可知,羥基苯甲酸總含量與黃烷醇類酚變化趨勢較為相似,3個品種均在轉色盛期達到最高含量,而后逐漸下降,采收時BH顯著高于PN和MS,BH為114.08 mg/kg,較PN和MS分別高12.27%、28.31%。3個品種中,阿魏酸作為底物多數轉化為香草酸,導致香草酸含量明顯增加而丁香酸含量較低。此外,原兒茶酸、2,5-二羥基苯甲酸和水楊酸以苯甲酸作為同一底物,三者存在競爭關系,MS和BH葡萄中原兒茶酸和2,5-二羥基苯甲酸更具有競爭優勢。

2.5.2 羥基肉桂酸

如圖5-a所示,共檢測出3種羥基肉桂酸,對香豆酸在3個品中變化趨勢相似,隨著果實成熟,表現為先上升后下降的趨勢,其為MS的主要成分,采收時占總含量的62.62%。BH中阿魏酸含量最高,采收時,占總含量的56.23%;而PN中3種物質含量相當。

a-羥基肉桂酸類酚含量變化分布圖;b-羥基肉桂酸總含量變化分布圖圖5 果實羥基肉桂酸含量變化Fig.5 Content changes of hydroxycinnamic acids in grapes注:HCI～HC3分別表示對香豆酸、阿魏酸和肉桂酸(下同)。

由圖5-b可知,隨著果實成熟,羥基肉桂酸總含量呈先上升后下降的趨勢,與羥基苯甲酸不同,3個品種均在成熟期含量達到最大值。MS在各時期均顯著高于BH和PN,采收時,含量分別為3.37、3.02、2.00 mg/kg。相較于其他非花色苷類酚,羥基肉桂酸含量較低,但其具有重要的作用,肉桂酸、對香豆酸和阿魏酸均為合成其他類酚的前體物質(圖6)。

PAL-苯丙氨酸解氨酶;C4H-肉桂酸-4-羥化酶;C3H-香豆酸-3-羥化酶;COMT-咖啡酸-O-甲基轉移酶;4CL-4-香豆酰輔酶A連接酶;CHS-查爾酮合酶;CHI-查爾酮異構酶;F3′H-類黃酮3′-羥化酶;F3′5′H-類黃酮3′5′-羥化酶;F3H-黃烷酮-3-羥化酶;FLS-黃酮醇合成酶;DFR-黃烷酮醇-4-還原酶;LAR-無色花色素還原酶;ECGT-沒食子酰基轉移酶;LDOX-無色花色素雙加氧酶;ANR-花色素還原酶圖6 非花色苷類酚代謝通路[15-16]Fig.6 Metabolic pathway of non-anthocyanins[15-16]

2.6 不同品種葡萄果實中芪類物質含量分析

由表3可知,隨著果實成熟,MS和BH中白藜蘆醇含量呈上升趨勢,而PN中略有差異。PN和BH白藜蘆醇含量在各時期均顯著低于MS,采收時MS含量高達5.24 mg/kg,分別為BH與PN的2.15和9.03倍。值得注意的是,BH中白藜蘆醇從轉色初期至成熟期含量均較低,其在采收期含量迅速上升。

表3 果實白藜蘆醇含量變化 單位:mg/kg FWTable 3 Content changes of resveratrol in grapes

2.7 不同品種葡萄果實酚類物質的主成分分析和差異物質篩選

為了探究3個品種葡萄果實中非花色苷類酚含量的差異,對采收期果實單體酚進行主成分分析(principal component analysis, PCA),結果如圖7所示。由圖7-a可知,t[1]和t[2]的累計貢獻率為97.6%,能夠很好的代表原始數據。t[1]解釋了總方差的67.1%,從x軸方向看,PN和BH位于x軸負半軸,MS位于x軸正半軸,t[1]能夠很好的將正、負半軸2個區域個區分開;t[2]解釋了總方差的30.5%,從y軸方向看,PN位于y軸正半軸,MS和BH位于y軸負半軸,t[2]能夠很好的區分開這兩部分。結合圖7-b可以看出,PN葡萄中單體酚成分主要分布在x軸負半軸和y軸正半軸,PN葡萄中兒茶素、表沒食子兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯含量更高;MS葡萄中單體酚成分主要分布在x軸正半軸和y軸負半軸,MS葡萄中丁香酸、芹菜苷、表兒茶素、S-圣草酚、對香豆酸、楊梅素、表兒茶素沒食子酸酯、白藜蘆醇和2,5-二羥基苯甲酸更高;BH葡萄中單體酚成分主要分布在x、y軸負半軸,BH葡萄中香草酸、水楊酸、蘆丁、槲皮苷、原兒茶酸、阿魏酸和表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量更高。

a-得分圖;b-載荷圖圖7 不同品種葡萄果實酚類物質的主成分分析Fig.7 Principal component analysis of phenolics in different varieties of grape berries

為進一步捕捉3個品種果實中單體酚特征差異物質,利用果實中單體酚含量數據進行有監督的正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA),所得到的模型可以很好的將3個品種區分開(圖8-a),模型的R2x、R2y和Q2值分別為0.976、0.996和0.992,表明模型擬合結果可接受。經過200次置換檢驗后,R2和Q2的縱截距分別為0.187和-0.719,說明模型無過擬合現象,模型驗證有效。采用變量重要性投影值(variable importance in projection, VIP)篩選3個品種果實中單體酚的特征差異化合物(圖8-b),其中VIP>1的物質是體現樣品間差異的主要成分。共篩選出10個VIP>1的物質,按貢獻度從高到低依次為兒茶素、表沒食子兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯、2,5-二羥基苯甲酸、柚皮素、阿魏酸、原兒茶酸、白藜蘆醇、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和槲皮苷。

a-正交偏最小二乘判別分析圖;b-差異物質篩選圖圖8 不同品種葡萄果實酚類物質的正交偏最小二乘判別分析及差異物質篩選Fig.8 OPLS-DA analysis of phenolics in grape berries of different varieties and screening of different substances

3 結論與討論

酚類物質對葡萄和葡萄酒的品質至關重要,盡管葡萄果實中酚類物質含量和組成受一系列環境和管理因素影響,但品種的基因型仍為主要影響因素[10,17]。本研究中發現‘黑比諾’總酚含量在成熟過程中均顯著高于‘馬瑟蘭’,而總單寧含量也表現為‘馬瑟蘭’(除轉色初期)顯著低于‘黑比諾’和‘北紅’,與前人研究相似[18]。與總酚和總單寧含量不同,本研究中3個品種總花色苷含量隨著成熟不斷上升,至采收時含量達到最高,與前人研究一致[19]。而在成熟過程中‘馬瑟蘭’總花色苷含量均顯著高于‘黑比諾’和‘北紅’,這與邢婷婷等[20]的研究較為相似。

葡萄果實中非花色苷類酚主要由黃烷醇、黃酮醇、酚酸和芪類物質組成,是葡萄中重要的生物活性物質。黃烷醇類酚主要存在于果皮和種子中,占葡萄總酚含量的13%～30%,其為本研究3個品種中主要的非花色苷類酚,主要體現在兒茶素含量上,這與前人在研究品麗珠及其不同營養系和赤霞珠葡萄中的結果一致[21-22],本研究中‘黑比諾’黃烷醇含量最高,可能相較于‘北紅’和‘馬瑟蘭’,其兒茶素合成更具有競爭優勢。黃酮醇類酚呈黃色,具有保護葡萄酒顏色的作用[23],本探究中,3個品種黃酮醇含量隨著成熟持續上升,與前人研究一致[19],同時本試驗中發現黃酮醇類物質含量較低,其可能原因為黃酮醇類酚主要以糖苷的形式存在于葡萄組織中[24]。葡萄果實中的酚酸類物質主要存在于果肉中,本研究3個品種主要的酚酸類酚為羥基苯甲酸,而肉桂酸類酚含量較低,可能原因為作為底物用于其他酚類物質合成,3個品種羥基苯甲酸含量差異主要體現在香草酸含量上,這與前人研究不同[25]。值得注意的是,本研究發現3個品種果實中黃酮醇和白藜蘆醇含量的變化趨勢與總花色苷極為相似,推測其可能原因為部分非花色苷酚起輔色作用能與花色苷糖苷部位結合[26-27],而至于其具體內在機制還需要進一步深入研究。

有研究表明,黃酮醇類酚含量和成分在不同品種中差異顯著,可以作為識別不同品種的標志[23,28]。本研究通過對采收時葡萄中非花色苷類酚進行PCA將3個品種很好的區分開,并篩選出每個品種中的特征非花色苷酚類物質,經過進一步的OPLS-DA,篩選出區分3個品種差異的物質主要為黃烷醇和酚酸類酚,與前人研究有所不同。

綜上所述,3個釀酒葡萄酚類物質含量因品種不同存在較大差異,其中黃烷醇類酚含量最高,主要體現在兒茶素上,‘黑比諾’葡萄黃烷醇含量顯著高于‘馬瑟蘭’和‘北紅’;羥基苯甲酸是含量第二高類酚,3個品種的主要作用成分為香草酸,‘北紅’顯著高于‘黑比諾’和‘馬瑟蘭’;‘馬瑟蘭’中黃酮醇、羥基肉桂酸和白藜蘆醇含量顯著高于其他品種。基于非花色苷類酚含量的PCA可以很好的區分3個品種,OPLS-DA進一步篩選出3個品種間差異的主要物質為黃烷醇類酚。