提取和干燥方式對肉蓯蓉提取物中有效成分的影響

楊國斌,韓玲,余群力,劉興龍,周鑫魁

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院,甘肅 蘭州,730010)2(酒泉職業技術學院,甘肅 酒泉,735000)3(甘肅中商食品質量檢驗檢測有限公司,甘肅 蘭州,730010)

肉蓯蓉(CistanchedeserticolaY.C.Ma),別名寸蕓、蓯蓉,屬瀕危種[1-2]。草本植物,大部分在地下生長,主要分布在我國甘肅、寧夏及新疆部分地區[3]。肉蓯蓉是一種寄生在沙漠中梭梭樹根部的寄生植物,素有“沙漠人參”之美譽,具有極高的食用價值,是中國傳統的藥食同源原料。從中醫角度來看,肉蓯蓉性甘、咸、溫。歸腎、大腸經,具有補腎陽,益精血,潤腸通便,緩解疲勞及抗衰老的功效[4];其作為藥用成分主要治療陽萎遺精、腰膝冷痛、筋骨無力、腸燥便秘,另外,據現代醫學分析肉蓯蓉中還含有豐富的苯乙醇苷類、環烯醚萜及其苷類、木脂素及其苷類、多糖、維生素等化合物和人體所需的銅、鋅、錳、鐵等微量元素[5-6]。這些微量元素具有延長動物壽命、調節內分泌、提高機體的新陳代謝的能力[7-8]。通過溶劑對肉蓯蓉中多種有效營養物質進行提取、濃縮和干燥去除溶劑,可以得到營養物質含量較高的提取產物。提取產物可以被用于滋補食品、保健藥品、養生茶等功效產品的生產加工中[9]。所以建立一種高效且節能環保的提取和干燥工藝方法,具有重要的現實意義。

針對藥物提取有很多種方式,包括:a)浸泡提取[10],該提取方式僅需要加入提取溶劑,不需要任何輔助條件,是最節約成本的提取方式,然而簡單的浸泡方式無法充分提取藥物中的有效成分,致使該方法很少被普及使用;b)加熱回流提取[11],該方法是應用較為廣泛的從藥物中有效物質的提取方式,但是該提取方法有一定隱患存在,因為在回流提取有效物質的同時會將藥物中的農藥殘留一起富集到提取產物中,是一種較高風險的方法;c)超聲輔助提取[12-13],該方法能增加溶劑分子及目標物分子間的相互作用,是一種新興的提取方式,但普通的超聲設備功率太小,無法突破藥材植物細胞壁,所以該提取方式提取效率有限;d)超臨界流體提取[14-16],是一種極具發展潛力的提取方式,提取介質使用無毒的CO2,且去除溶劑的方式更加快速簡單,極少存在溶劑殘留問題;e)亞臨界水提取[17-19],亞臨界水是指將水加熱到沸點以上,臨界點以下,并控制系統壓力使水保持為液體狀態。亞臨界水具有很多優秀的特點,如亞臨界水的介電常數可以隨著溫度的變化而改變,在實際應用中,可以通過控制特定的溫度,促使亞臨界水呈現不同的極性,可以提取特殊極性范圍的物質[20]。另外一個顯著的特點是其擁有較高的離子積,即高濃度的氫離子和氫氧根離子。常溫常壓下水的離子積是10-14,當溫度升高到200～300 ℃時,亞臨界水中水分子也會電離產生更多的氫離子和氫氧根離子,離子積可以達到10-11,較常溫常壓下提高了1 000倍,更容易與一些路易斯酸堿性物質結合,提高萃取效果[21-22]。同時隨著溫度的升高,水分子的氫鍵作用會減弱,氫鍵數量也會減少,亞臨界水的黏度和表面張力隨著溫度的升高而降低,較低的黏度和表面張力有利于物質的傳遞和滲透,從而提高了提取效率,基于亞臨界水的諸多特性,可以考慮用于肉蓯蓉提取工作中。

本文利用亞臨界水和超臨界流體等4種提取方法分別對肉蓯蓉的有效成分進行提取,對提取產物中的肉蓯蓉苷類物質(京尼平苷酸、松果菊苷、肉蓯蓉苷 A、2′-乙酰基毛蕊花糖苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷),維生素類物質(維生素B1、維生素B2、維生素B6),微量元素(銅、鐵、錳、鋅),農藥殘留(克百威、甲基異硫磷、甲拌磷、毒死蜱)四類物質進行檢測,確定其含量,通過評價提取產物的品質,對比4種提取方法,篩選最優提取方法;同時將得到的提取物通過冷凍真空冷凍干燥、常壓烘干、減壓烘干的方法去除溶劑,得到肉蓯蓉提取物干粉,再次檢測干粉中有效物質含量,評價3種干燥方法對肉蓯蓉干粉的品質影響,為進一步開發肉蓯蓉副產品奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉蓯蓉樣品,甘肅金沙源生物科技有限公司;乙醇、乙腈、甲醇,均為色譜純,北京百靈威科技有限公司;京尼平苷酸(98.5%)、松果菊苷(99.5%)、肉蓯蓉苷A(99.7%)、2′-乙酰基毛蕊花糖苷(99.5%)、毛蕊花糖苷(98.7%)、異毛蕊花糖苷(97.5%)、維生素B1(99.5%)、維生素B2(98.5%)、維生素B6(99.7%)、克百威(97.5%)、甲基異硫磷(97.5%)、甲拌磷(97.5%)、毒死蜱(97.5%)、銅、鐵、錳、鋅(液態標準,1.00 mg/L),標準品,德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設備

1260型液相色譜儀,配二級管陣列檢測器、7500型電感耦合等離子體質譜儀,安捷倫科技有限公司;GCMS-QP2020 NX氣相色譜-串聯三重四極桿質譜,島津科技有限公司;RE-52AA型旋轉蒸發儀,上海亞榮生化儀器廠;RX-II型離心機,天美中國科學儀器有限公司;5L-100L亞臨界水提取系統,鯤華生物技術有限公司;HA220-50-06超臨界流體萃取設備,北京世紀森朗實驗儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 亞臨界水對肉蓯蓉最佳提取壓力及溫度條件優化

對亞臨界水提取肉蓯蓉的壓力,溫度條件進行篩選優化。分別選擇303、404、505、606、707 kPa 5個壓力條件和200、210、220、230、240、250、300 ℃ 7個溫度條件,做35組棋盤實驗。檢測每組提取液中肉蓯蓉苷A化合物,參考苷類化合物的含量,選擇最佳提取壓力和溫度。

1.3.2 亞臨界水對肉蓯蓉最佳提取時間選擇

分別選擇5、7.5、10、12.5、15、17.5、20 min 7個不同提取時間提取肉蓯蓉,檢測每組提取液中肉蓯蓉苷A化合物,參考苷類化合物的含量,選擇最佳提取時間。

1.3.3 肉蓯蓉樣品粉碎制備

根據文獻[23]方法:將干燥的肉蓯蓉樣品粉碎過40目篩,得到粉狀篩下物,按照振動篩分方法,將樣品分成若干等份,待用。

1.3.4 亞臨界水提取

稱取肉蓯蓉樣品10.00 g,放入亞臨界水提取系統的提取釜中,加入200 mL純水,密封好系統,在505 kPa壓力,230 ℃條件下,提取15 min,得到的產物標記為1號產物。

1.3.5 回流提取

稱取肉蓯蓉樣品10.00 g,放入圓底燒瓶中,加入200 mL純水,密封好回流系統,在常壓,微沸騰條件下回流30 min,得到的產物標記為2號產物。同時按上述條件將200 mL純水替換為200 mL乙醇,實施實驗,得到的產物標記為3號產物。

1.3.6 超聲提取

稱取肉蓯蓉樣品10.00 g,放入錐型瓶中,加入200 mL純水,密封好錐型瓶,在常壓下,超聲提取(600 W,42 kHz) 40 min,得到的產物標記為4號產物。同時按上述條件將200 mL純水替換為200 mL乙醇,實施實驗,得到的產物標記為5號產物。

1.3.7 超臨界流體提取

稱取肉蓯蓉樣品10.00 g,放入超臨界流體提取設備的提取釜中,密封好錐型瓶,完成提取,得到的產物標記為6號產物。

1.3.8 肉蓯蓉苷含量測定

根據參考文獻[24]方法,將1號～5號產物用相應的提取溶劑定容至500 mL,6號產物用甲醇溶解,定容至500 mL。得到樣品待測液,過0.22 μm微孔濾膜后,按照以下色譜條件進入液相色譜檢測。色譜柱:ODS C18柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈-0.5%(體積分數)乙酸水溶液,檢測波長:237 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:20 μL。分別精密稱取10.0 mg有效含量的各標準品,置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解定容,得到1 000.0 μg/mL的標準儲備液,使用時用甲醇稀釋為適當濃度。本實驗使用1.0～100.0 μg/mL的標準系列校準產物中目標物含量,以濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,得到校準曲線如表1所示。含量計算如公式(1)所示:

表1 六種苷類物質校準曲線Table 1 Calibration curves of six glycosides

(1)

式中:X為目標物含量,mg/g;c為由標準曲線校準得到的樣品液中目標物含量,μg/mL;V為樣品液體積,500 mL;m為樣品質量,10.0 g;1 000為毫克與微克的換算系數。

1.3.9 維生素含量測定

根據參考文獻[25]方法檢測維生素B1,參考文獻[26]方法檢測維生素B2,參考文獻[27]方法檢測維生素B6。將1號～6號產物的樣品待測液過0.22 μm微孔濾膜后,按照以下色譜條件進入液相色譜檢測。色譜柱:ODS C18柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈-pH值為3.5的乙酸銨水溶液,維生素B1激發波長:365 nm,發射波長:425 nm;維生素B2激發波長:462 nm,發射波長:522 nm;維生素B6激發波長:293 nm,發射波長:395 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:20 μL。分別精密稱取10.0 mg有效含量的各標準品,置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解定容,得到1 000.0 μg/mL的標準儲備液。使用時用pH值為3.5的乙酸銨水溶液稀釋為適當濃度。本實驗使用50.0～1 000.0 ng/mL的標準系列校準產物中目標物含量。以濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,得到校準曲線如表2所示。含量計算如公式(2)所示:

表2 維生素類物質校準曲線Table 2 Calibration curve for vitamins

(2)

式中:X為目標物含量,mg/100 g;c為由標準曲線校準得到的樣品液中目標物含量,μg/mL;V為樣品液體積,500 mL;m為樣品質量,10.0 g;1 000為毫克與微克的換算系數;100為每克與每一百克的換算系數。

1.3.10 微量元素含量測定

根據參考文獻[28]方法,將1號～6號產物的樣品待測液濃縮至干,精密稱取0.200～0.500 g濃縮產物,置于聚四氟乙烯消解罐內,加硝酸6 mL,混勻,浸泡過夜,蓋好內蓋,旋緊外套,置于微波消解爐內,進行消解。測定時,精密量取銅、鐵、錳、鋅標準品貯備液適量,用2%硝酸溶液稀釋制一定系列濃度混合溶液,同時選取63Cu以72Ge作為內標,56Fe以45Sc作為內標,55Mn以45Sc作為內標,66Zn以72Ge作為內標,并根據儀器的要求選用適宜校正方程對測定的元素進行校正,該儀器使用內置曲線對樣品液校準,所得到的信號為樣品液中目標物濃度。將待測液過0.22 μm微孔濾膜后,進入ICP-MS測定銅、鐵、錳、鋅的含量。含量計算如公式(2)所示。

1.3.11 農藥殘留含量測定

根據參考文獻[29]方法,將1號～6號產物的樣品待測液濃縮至近干,加入2 mL乙腈復溶,并用乙腈定容至5.0 mL,經QuEChERS處理后,過0.22 μm微孔濾膜后,按照以下色譜條件進入進入氣相色譜-三重四極桿質譜檢測。色譜柱:DB-5MS石英毛細管柱[30 m×0.25 mm(內徑)×0.25 μm];進樣口溫度:250 ℃;升溫程序:70 ℃(1 min)→25 ℃/min→120 ℃→30 ℃/min→300 ℃(2 min);載氣:氦氣(純度≥99.999%),流速:1.0 mL/min;進樣量:1 μL;質譜條件:色譜與質譜接口溫度:250 ℃;離子源溫度:230 ℃;電離方式:電子轟擊源(electron impact ion source,EI);電離能量:70 eV。每種農藥分別選擇一對定量離子,一對定性離子,每組所需檢測離子對,按照出峰順序,分時分段監測,根據豐度值外標法定量。以濃度為橫坐標,豐度值為縱坐標,得到校準曲線如表3所示。含量計算如公式(3)所示:

表3 農藥殘留類物質校準曲線Table 3 Calibration curve for pesticide residues

(3)

式中:X為目標物含量,mg/kg;c為由標準曲線校準得到的樣品液中目標物含量,μg/mL;V為樣品液體積,500 mL;m為樣品質量,10.0 g。

1.3.12 提取物粉末中有效物質含量

稱取1 000 g肉蓯蓉樣品,按照“1.3.2節”方法得到的產物提取液,分別通過真空冷凍干燥,常壓蒸干,減壓蒸干的方式去除溶劑,得到干粉。按方法“1.3.6節～1.3.9節”的條件將干粉復溶至500 mL,分別檢測干粉中的肉蓯蓉苷、維生素、微量元素和農藥殘留含量。對比真空冷凍干燥,常壓蒸干,減壓蒸干3種干燥方式,選出營養物質損失最少的一種方式。

2 結果與分析

2.1 亞臨界水提取肉蓯蓉的最佳壓力和溫度條件

5個壓力條件和7個溫度條件,總計35組棋盤實驗結果如表4所示。

表4 提取溫度和壓力條件棋盤實驗結果Table 4 Optimal results of temperature and pressure conditions for subcritical water extraction

由表4可知,亞臨界水提取肉蓯蓉,隨溫度和壓力的升高,提取液中苷類物質含量越高,最高達到1.44 mg/g。當壓力大于505 kPa時,升高壓力,其提取液中肉蓯蓉苷A含量增加不明顯,當壓力小于505 kPa時,升高提取系統溫度,也不能完全將肉蓯蓉苷類物質提取出來。而在505 kPa壓力下,溫度升高到230 ℃時,已經將樣品中全部苷類物質提取到提取液中,繼續升高溫度只會增加提取成本,不會得到更大收益。所以本實驗選擇505 kPa,230 ℃條件下,使用亞臨界水提取肉蓯蓉中的有效營養物質。

2.2 亞臨界水提取肉蓯蓉的最佳提取時間

由圖1可知,亞臨界水提取肉蓯蓉,提取液中肉蓯蓉苷A的含量隨提取時間延長而增加,但是當提取時間超過10 min后,延長提取時間,肉蓯蓉苷A含量增加變慢,當提取時間到15 min時,亞臨界水能將樣品中全部苷類物質提取出來,含量達到1.44 mg/g。繼續延長提取時間只會增加提取成本,不會得到更大收益。所以本實驗選擇提取時間為15 min,使用亞臨界水提取肉蓯蓉中的有效營養物質。

圖1 不同提取時間提取液中肉蓯蓉苷A的含量Fig.1 Content of Cistanche glycoside A in different extraction time

2.3 不同提取產物中肉蓯蓉苷類物質含量對比

不同提取產物中肉蓯蓉苷類物質含量對比如表5所示,色譜圖見圖2所示。

1-甲京尼平苷酸;2-松果菊苷;3-肉蓯蓉苷A;4-毛蕊花糖苷;5-異毛蕊花糖苷;6-2′-乙酰基毛蕊花糖苷圖2 肉蓯蓉苷類物質液相色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of Cistanche glycoside

表5 不同提取產物中肉蓯蓉苷類物質含量 單位:mg/gTable 5 Content of Cistanche glycoside in different extracts

由表5可知,亞臨界水提取方式對6種肉蓯蓉苷類物質提取效果最佳,6種苷類物質含量分別達到:1.63、12.34、1.44、1.36、2.41、2.31 mg/g;平均提取效率比超臨界流體提取高2.93%;比乙醇溶劑回流提取高6.08%;比水溶劑回流提取高30.28%;比乙醇溶劑超聲提取高18.95%;比水為溶劑超聲提取高40.63%。水為溶劑超聲提取效果最不理想,這是因為苷類物質都存在于植物細胞內部,而且更加易溶于中等極性的有機試劑,所以乙醇作為溶劑提取的效果明顯高于水作溶劑的效果。而簡單的超聲輔助提取,不足以使苷類物質完全突破植物細胞壁,需要更劇烈的方式使植物細胞壁完全破裂。回流提取需要在加熱煮沸條件下,提取效果也相對提高,超臨界流體只有通過二氧化碳流體在特殊壓力下才能將細胞內的物質完全提取出來,而亞臨界水提取條件為高溫高壓,完全破壞了植物細胞壁,很容易將細胞內有效物質全部溶出,相比于其他幾種提取方式是一種環保高效的提取方式。由圖2可知,6種肉蓯蓉苷在該色譜條件下被完全分離,峰沒有重疊,前沿或拖尾現象,確保定量定性結果準確穩定。

2.4 不同提取產物中維生素類物質含量對比

由表6可知,亞臨界水提取方式對維生素類物質提取效果最佳,維生素B1含量達到0.024 mg/100 g,維生素B2含量達到0.021 mg/100 g,維生素B6含量達到0.044 mg/100 g。其效果與水和乙醇作為溶劑回流提取效果相當;平均提取效率比超臨界流體提取高6.64%;比乙醇溶劑超聲提取高34.56%;比水為溶劑超聲提取高35.75%。因為僅超聲提取效果不完全。其他提取方式都能完全提取肉蓯蓉中的維生素。是因為維生素B1、維生素B2、維生素B6都是水溶性維生素,在水和中等極性溶劑中都極易溶解。所以在回流,加壓等劇烈提取方式下,都能將目標物全部提取出來。而亞臨界水提取時間短,僅需要15 min,且更加綠色環保。由圖3可知,3種維生素在各自色譜條件下出現的色譜峰,對稱性良好,有利于定性定量檢測結果的準確性和穩定性。

a-維生素B1;b-維生素B2;c-維生素B6圖3 肉蓯蓉維生素類物質液相色譜圖Fig.3 Vitamin liquid chromatography

表6 不同提取產物中維生素類物質含量 單位:mg/100 gTable 6 Content of vitamin in different extracts

2.5 不同提取產物中微量元素含量對比

肉蓯蓉中含有銅、鋅、鐵、錳等對人體有益的微量元素,由表7可知,亞臨界水提取方式對微量元素提取效果:銅元素含量達到0.94 mg/100 g,鋅元素含量達到1.13 mg/100 g,鐵元素含量達到4.66 mg/100 g,錳元素含量達到1.04 mg/100 g。其效果與水作為溶劑回流提取效果相當,平均提取效率比超臨界流體提取高97.34%、比水為溶劑超聲提取高47.07%、比乙醇溶劑超聲提取和回流提取高99.22%。這是因為微量元素易溶于水,極難溶于有機溶劑中,所以使用亞臨界水提取,水溶劑回流提取方式都能將樣品中微量元素充分提取出來,乙醇和超臨界流體作溶劑提取基本無法將微量元素溶解到溶劑中。說明亞臨界水提取方式有利于將肉蓯蓉樣品中的微量元素提取到提取液中。

表7 不同提取產物中微量元素的含量 單位:mg/100 gTable 7 Content of trace elements in different extracts

2.6 不同提取產物中農藥殘留含量對比

由表8可知,亞臨界水提取方式對農藥殘留提取效果:克百威含量為0.004 mg/100 g,甲拌磷含量為0.005 mg/100 g,甲基異硫磷含量為0.012 mg/100 g,毒死蜱含量為0.006 mg/100 g。其效果與水作為溶劑回流提取和超聲提取效果相當,平均提取效率比超臨界流體提取低84.47%、比乙醇為溶劑超聲提取低72.89%、比乙醇為溶劑回流提取低83.25%。這是因為樣品中含有少量脂溶性的農藥殘留,超臨界流體對農藥殘留具有極好的溶解性,幾乎可以將樣品中殘留的農藥完全提取出來。乙醇對農藥殘留的提取效果次之,且回流提取方式優于超聲提取方式。亞臨界水提取、水溶劑回流提取和超聲提取都無法將脂溶性農藥殘留物質提取到提取液中。而農藥殘留是對食用者有害的物質,應當含量越少越好。由圖4可知,該色譜和質譜條件,能完全分離4種農藥殘留,互不影響。

1-甲拌磷;2-克百威;3-毒死蜱;4-甲基異硫磷圖4 肉蓯蓉中農藥殘留質譜圖Fig.4 Mass spectrum of pesticide residues in Cistanche

綜合以上實驗結果,超聲輔助提取方式對營養物質的提取效率最低。用水作溶劑回流提取也不能將全部營養物質提取出來。而乙醇回流提取、超臨界流體提取,亞臨界水提取、都能將肉蓯蓉中苷類物質,維生素類物質完全提取出來,但是乙醇回流提取,超臨界流體提取方式無法有效提取樣品中對食用者有益的微量元素,還會將樣品中殘留的農藥提取到提取液中,可能導致后續產品存在農藥殘留。亞臨界水提取方式不僅能有效地提取樣品中苷類物質、維生素、有益微量元素,同時大幅減少對農藥殘留物質的提取,是一種對保健食品研發友好的提取方式。

2.7 干燥方式對干粉產物中各物質含量的影響

由表9可知,樣品提取液干燥條件的溫度越高,有效營養物質的損失也越大,真空冷凍方式能有效保留提取液中有效營養物質,減壓干燥得到的粉末,其中肉蓯蓉苷類物質含量平均下降16.53%,維生素B1含量下降25.00%,維生素B2含量下降23.81%,維生素B6含量下降9.09%。常壓干燥得到的粉末,其中肉蓯蓉苷類物質含量平均下降28.36%,維生素B1含量下降54.17%,維生素B2含量下降57.14%,維生素B6含量下降13.64%。而且溫度升高提取液中有效物質也容易和氧氣發生氧化反應,導致最終干燥產物質量增加,且減壓蒸干和常壓蒸干得到堅硬的塊狀濃縮產物,而冷凍真空干燥得到粉狀產物,經簡單研磨過篩后,可以方便制備其衍生產品。

表9 不同干燥方式對干粉中各物質含量的影響Table 9 Effects of different drying methods on the content of various substances in dry powder

3 結論

亞臨界水在料液比1：20,505 kPa壓力,230 ℃條件下,提取15 min,能將肉蓯蓉樣品中肉蓯蓉苷類物質、維生素類物質、微量元素提取到提取液中,并且不會將樣品中對食用者有害的農藥殘留提取到提取液中,較超聲提取、回流提取、超臨界流體萃取有明顯優勢,同時亞臨界水提取更加綠色、環保。在對提取液的干燥處理中,真空冷凍干燥法較其他幾種干燥方法能更好地保留提取液中的有效營養成分。綜上所述,亞臨界水提取結合真空冷凍干燥對制備肉蓯蓉干粉是較為理想的方式。