半枝蓮多糖不同給藥方式對大鼠肝癌模型血管生成的影響

張玉穗,劉 嶸,丁 遠

(貴州中醫藥大學第一附屬醫院放射科,貴州 貴陽 550000)

半枝蓮為唇形科植物半枝蓮的干燥全草,具清熱解毒、散癖止血、利尿消腫之功效,近些年的研究發現其具有很好的抗腫瘤活性[1-3],已經成為國內外抗腫瘤中藥研究的熱點[4-5]。研究發現半枝蓮的主要生物活性成分半枝蓮多糖(Scutellaria barbata polysaccharides,SBPS)可以提升小鼠溶血素水平[6]并抑制小鼠體內腫瘤的生長[7]。腫瘤生長的過程需要汲取營養物質,故隨著腫瘤體積的增大,腫瘤周邊基質會形成新生血管[8],這種新生血管是腫瘤發生遠處轉移的重要通道[9-10]。因此,抑制血管生成一直都是對抗腫瘤的重要研究方向。血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)在腫瘤血管的發生和生長過程中具有極為重要的作用,血清VEGF的水平可以對腫瘤預后做出評估[11-12]。本研究基于大鼠肝癌細胞模型,以VEGF為指標觀察半枝蓮多糖對腫瘤組織中血管生成的影響,并對其作用機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和瘤株

研究選取4～6周齡Nu/Nu裸鼠24只,體重200g左右,購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。肝癌HepG2瘤株購自于中國醫學科學院腫瘤研究所。

1.2 實驗材料和試劑

半枝蓮多糖為中藥半枝蓮飲片通過水煮醇沉方式獲得的提取物,由本實驗室提供,藥材購買于購自寧波德康生物制品有限公司;反轉錄試劑盒購自GeneStar公司;注射用氨基甲酸購自上海儒吉生物科技發展有限公司;泛影葡胺購自上海旭東海普藥業;高糖細胞培養液(DMEM)購自Gibco公司;慶大霉素購自西南藥業股份有限公司;CD34購自Abcam公司;VEGF單克隆抗體購自Abcam公司(貨號:ab68334);中杉金橋二步法免疫組化檢測試劑盒(貨號:K116812c);DAB顯色試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1細胞培養

HepG2細胞加入10% FBS的DMEM的完全培養基,細胞匯合度達到80%時進行傳代,備用。

1.3.2裸鼠肝細胞癌(HCC)模型的建立

將處于對數期的HepG2細胞稀釋至2106 cells/mL,取250μL細胞懸液接種于大鼠皮下,待皮下瘤長至直徑5～6mm時取下作為瘤源。裸鼠用200g/L烏拉坦注射腹腔進行麻醉,左上腹肋緣下斜切口長約6～8cm,暴露肝臟左葉,用尖鑷在肝左葉最厚區域刺破肝被膜,棉簽輕壓刺破口,再用尖鑷準確送入1～2塊瘤組織,觀察無出血后,全層關腹。原位種植后的7、14、21、28和35天進行CT掃描,觀察腫瘤生長狀態。

1.3.3裸鼠經肝動脈化療栓塞術(TACE)模型的建立

選取荷瘤模型成功且狀態良好的HepG2-luc大鼠,用200g/L烏拉坦腹腔麻醉,切開皮膚,充分暴露腹腔,在DSA監控下,借助于超滑導絲引導,將2F硅膠管經胃十二指腸動脈超選擇逆行插管至肝左動脈,注入200μL 76%泛影葡胺,減影確認后,經肝動脈行灌注化療術。術畢,拔出導管,結扎胃十二指腸動脈,同時腹腔內注射含慶大霉素8萬單位的生理鹽水,逐層關腹。

1.3.4裸鼠體內給藥

選取荷瘤模型成功且狀態良好的HCC裸鼠24只,隨機分為:口服半枝蓮多糖組、經肝動脈注射半枝蓮多糖組、對照組,每組8只。其中前兩組每次給藥100mg/kg,共給藥3次,每次間隔1周;對照組按照同樣的處理給予同體積的生理鹽水。

1.3.5荷瘤鼠抑瘤率的影響分析

末次給藥24h后,頸椎脫臼處理大鼠,常規方法稱取實體瘤重量,計算半枝蓮多糖抑制荷瘤鼠腫瘤生長的百分率(抑瘤率)。抑瘤率=(對照組平均瘤重-口服或經肝動脈注射半枝蓮多糖組平均瘤重)/對照組平均瘤重100%。

1.3.6微血管密度(Microvessels Density,MVD)測定

將大鼠腫瘤組織剝離,放入10%中性甲醛進行固定,進行石蠟包埋并切片,選擇小鼠CD34單克隆抗體(1:10)作為一抗進行免疫組化檢測與分析。首先于低倍鏡下掃描切片,定位MVD高密度區域,再于400倍視野下定位于腫瘤中心并對腫瘤邊緣的微血管數目進行計數,每個樣本隨機統計5個不同的視野區域,計算樣本MVD平均值。

1.3.7qPCR檢測VEGF

提取各組大鼠腫瘤組織樣品,Trizo法提取組織樣本RNA,按照GeneStar 反轉錄試劑盒進行cDNA鏈的合成,隨后按照CORNING公司SYBR Green Mix定量試劑盒進行qPCR反應檢測VEGF表達量,引物序列為F:5’-TTGCCTTGCTGCTCTACCTCCA,R:5’-GATGGCAGTAGCTGCGCTGATA。同時以NADPH為內參對照,引物序列為F:5’-GCCAGAGTATCACTACCTCCAC, R:5’-CTCGGAGGTAAGCCAAGAGTGT。

1.3.8Western Blot檢測VEGF表達量

液氮研磨大鼠腫瘤組織樣本,勻漿器勻漿,取適量加入100μLPBS重懸,然后加入25μL 5蛋白上樣緩沖液,混勻,沸水中作用10min,制備蛋白樣品進行SDS-PAGE,然后利用濕轉法將蛋白轉至平PVDF膜,用5%脫脂奶粉封閉1h,一抗小鼠VEGF單克隆抗體(1:2000),4℃孵育過夜,TBST清洗5次,每次5min,然后與HRP標記的兔抗鼠IgG(1:5000稀釋)作用1h,TBST清洗5次,每次5min,然后ECL顯色。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 半枝蓮多糖不同給藥方式對HCC裸鼠瘤重的影響

給藥組降低腫瘤重量指標高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。其中,肝動脈灌注給藥組較口服組抑瘤率更加明顯,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1、2。

圖1 各組大鼠平均瘤重注:與模型對照組相比,***P<0.001,*P<0.05;與口服組相比,##P<0.01。

2.2 qPCR檢測腫瘤組織VEGF表達量

分別取各組腫瘤組織,液氮研磨提取RNA,反轉制備cDNA,以此為模板檢測VEGF表達量,結果顯示如圖2。對照組VEGF mRNA水平高于給藥組,差異有統計學意義(P<0.05);且口服組和肝動脈灌注組比較結果發現,前者VEGF mRNA水平高于后者,差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 各組肝癌組織中VEGF的mRNA的相對表達量注:與模型對照組相比,***P<0.001,**P<0.01;與口服組相比,##P<0.01。

2.3 Western blot 檢測各組腫瘤VEGF表達量

蛋白免疫印跡顯示對照組VEGF蛋白表達量顯著高于給藥組,差異有統計學意義(P<0.05);口服組和肝動脈灌注組比較結果發現,前者VEGF 蛋白表達量顯著高于后者,差異有統計學意義(P<0.05)。詳見圖3。

圖3 各組肝癌組織中VEGF蛋白表達水平注:與對照組相比,***P<0.001,*P<0.05;與口組相比,##P<0.01。

2.4 半枝蓮多糖對MVD的影響

對照組組織中MVD的平均值為(13.62±3.12)個/視野,肝動脈灌注組大鼠MVD的平均值為(7.45±1.52)個/視野,口服組MVD的平均值為(11.16±2.34)個/視野。統計學分析顯示,較對照組,經肝動脈灌注半枝蓮多糖可顯著抑制肝癌組織中微血管的形成(P<0.05)。詳見圖4。

圖4 三組肝癌組織中MVD數量分析上圖為癌癥樣本組織化學分析,箭頭指示CD34陽性的微血管,400倍視野下微血管密度計數;下圖為腫瘤中MVD的量化分析。注:肝動脈灌注組與對照組相比,*P<0.05。

3 討論

目前,原發性肝癌是目前發病率最高的惡性腫瘤之一,在全球惡性腫瘤發病率中排第6位,其引發的死亡在腫瘤致死率中排第3位[13-14]。絕大多數肝癌血供豐富,惡質病、轉移率高、切除復發性高等因素是影響其預后的重要原因[15-16]。肝癌組織的血管是癌細胞進行代謝的重要結構基礎,抑制血管生成相關因子如bFGF、VEGF,可以直接有效地抑制腫瘤血管的生成進而抑制腫瘤的生長,因此抑制肝癌血管生長是目前臨床治療肝癌的重要干預手段[17-18]。VEGF在增加腫瘤血管通透性、促進血管生長中具有關鍵性作用,故目前針對VEGF及其受體開發的藥物,如貝伐珠單抗、索拉非尼等在肝癌臨床治療中取得了重要應用[19]。

多糖是自然界常見的天然大分子藥物,不斷的研究發現多糖在抗腫瘤中起到了重要作用[20]。半枝蓮多糖是中藥半枝蓮的重要生物活性物質之一。張秀娟團隊發現半枝蓮多糖可以顯著抑制S180肉瘤在體內的生長[21],隨后有報道稱半枝蓮多糖可以抑制大鼠HepA腫瘤的生長,增強大鼠機體免疫機能[22]。于水瀾等人通過分析半枝蓮多糖干預對肝癌大鼠差異表達蛋白質的影響,結果發現其可以調節肝癌血清中多蛋白調節實現對腫瘤生長的抑制[23]。但是目前,對于半枝蓮多糖對肝癌血管組織血管生長的影響還未見報道。

本研究通過建立裸鼠HCC模型,分別給予口服和肝動脈灌注的方法給予半枝蓮多糖治療,隨后對其抑瘤率、VEGF表達、肝癌組織MVD的影響進行分析。結果發現半枝蓮多糖可以顯著抑制裸鼠肝癌組織的生長,其中肝動脈灌注比口服取得的抑瘤效果更加明顯。VEGF的mRNA和蛋白表達水平檢測發現半枝蓮多糖能夠顯著降低VEGF在腫瘤組織中的表達,而且肝動脈灌注取的效果更加明顯。為了更加直觀的展示半枝蓮對腫瘤組織血管生成的影響,我們進行了免疫組織化學檢測,結果發現肝動脈灌注半枝蓮多糖的方法取得了最佳的血管抑制效果,雖然口服半枝蓮多糖相比于對照組微血管密度有所降低,但是差異不顯著,該結果和之前的檢測基本吻合。

綜上所述半枝蓮多糖可以有效抑制肝臟組織中VEGF的表達,從而抑制肝癌組織中微血管的生成,繼而實現抑制肝癌的效果。肝動脈灌注半枝蓮多糖相比于口服能夠達到更佳的治療效果,為半枝蓮多糖在肝癌臨床的治療提供參考。