半枝蓮多糖不同給藥方式對大鼠肝癌模型血管生成的影響

張玉穗,劉 嶸,丁 遠

(貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院放射科,貴州 貴陽 550000)

半枝蓮為唇形科植物半枝蓮的干燥全草,具清熱解毒、散癖止血、利尿消腫之功效,近些年的研究發(fā)現(xiàn)其具有很好的抗腫瘤活性[1-3],已經(jīng)成為國內(nèi)外抗腫瘤中藥研究的熱點[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)半枝蓮的主要生物活性成分半枝蓮多糖(Scutellaria barbata polysaccharides,SBPS)可以提升小鼠溶血素水平[6]并抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長[7]。腫瘤生長的過程需要汲取營養(yǎng)物質(zhì),故隨著腫瘤體積的增大,腫瘤周邊基質(zhì)會形成新生血管[8],這種新生血管是腫瘤發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的重要通道[9-10]。因此,抑制血管生成一直都是對抗腫瘤的重要研究方向。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)在腫瘤血管的發(fā)生和生長過程中具有極為重要的作用,血清VEGF的水平可以對腫瘤預后做出評估[11-12]。本研究基于大鼠肝癌細胞模型,以VEGF為指標觀察半枝蓮多糖對腫瘤組織中血管生成的影響,并對其作用機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和瘤株

研究選取4～6周齡Nu/Nu裸鼠24只,體重200g左右,購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。肝癌HepG2瘤株購自于中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所。

1.2 實驗材料和試劑

半枝蓮多糖為中藥半枝蓮飲片通過水煮醇沉方式獲得的提取物,由本實驗室提供,藥材購買于購自寧波德康生物制品有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自GeneStar公司;注射用氨基甲酸購自上海儒吉生物科技發(fā)展有限公司;泛影葡胺購自上海旭東海普藥業(yè);高糖細胞培養(yǎng)液(DMEM)購自Gibco公司;慶大霉素購自西南藥業(yè)股份有限公司;CD34購自Abcam公司;VEGF單克隆抗體購自Abcam公司(貨號:ab68334);中杉金橋二步法免疫組化檢測試劑盒(貨號:K116812c);DAB顯色試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1細胞培養(yǎng)

HepG2細胞加入10% FBS的DMEM的完全培養(yǎng)基,細胞匯合度達到80%時進行傳代,備用。

1.3.2裸鼠肝細胞癌(HCC)模型的建立

將處于對數(shù)期的HepG2細胞稀釋至2106 cells/mL,取250μL細胞懸液接種于大鼠皮下,待皮下瘤長至直徑5～6mm時取下作為瘤源。裸鼠用200g/L烏拉坦注射腹腔進行麻醉,左上腹肋緣下斜切口長約6～8cm,暴露肝臟左葉,用尖鑷在肝左葉最厚區(qū)域刺破肝被膜,棉簽輕壓刺破口,再用尖鑷準確送入1～2塊瘤組織,觀察無出血后,全層關腹。原位種植后的7、14、21、28和35天進行CT掃描,觀察腫瘤生長狀態(tài)。

1.3.3裸鼠經(jīng)肝動脈化療栓塞術(TACE)模型的建立

選取荷瘤模型成功且狀態(tài)良好的HepG2-luc大鼠,用200g/L烏拉坦腹腔麻醉,切開皮膚,充分暴露腹腔,在DSA監(jiān)控下,借助于超滑導絲引導,將2F硅膠管經(jīng)胃十二指腸動脈超選擇逆行插管至肝左動脈,注入200μL 76%泛影葡胺,減影確認后,經(jīng)肝動脈行灌注化療術。術畢,拔出導管,結(jié)扎胃十二指腸動脈,同時腹腔內(nèi)注射含慶大霉素8萬單位的生理鹽水,逐層關腹。

1.3.4裸鼠體內(nèi)給藥

選取荷瘤模型成功且狀態(tài)良好的HCC裸鼠24只,隨機分為:口服半枝蓮多糖組、經(jīng)肝動脈注射半枝蓮多糖組、對照組,每組8只。其中前兩組每次給藥100mg/kg,共給藥3次,每次間隔1周;對照組按照同樣的處理給予同體積的生理鹽水。

1.3.5荷瘤鼠抑瘤率的影響分析

末次給藥24h后,頸椎脫臼處理大鼠,常規(guī)方法稱取實體瘤重量,計算半枝蓮多糖抑制荷瘤鼠腫瘤生長的百分率(抑瘤率)。抑瘤率=(對照組平均瘤重-口服或經(jīng)肝動脈注射半枝蓮多糖組平均瘤重)/對照組平均瘤重100%。

1.3.6微血管密度(Microvessels Density,MVD)測定

將大鼠腫瘤組織剝離,放入10%中性甲醛進行固定,進行石蠟包埋并切片,選擇小鼠CD34單克隆抗體(1:10)作為一抗進行免疫組化檢測與分析。首先于低倍鏡下掃描切片,定位MVD高密度區(qū)域,再于400倍視野下定位于腫瘤中心并對腫瘤邊緣的微血管數(shù)目進行計數(shù),每個樣本隨機統(tǒng)計5個不同的視野區(qū)域,計算樣本MVD平均值。

1.3.7qPCR檢測VEGF

提取各組大鼠腫瘤組織樣品,Trizo法提取組織樣本RNA,按照GeneStar 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA鏈的合成,隨后按照CORNING公司SYBR Green Mix定量試劑盒進行qPCR反應檢測VEGF表達量,引物序列為F:5’-TTGCCTTGCTGCTCTACCTCCA,R:5’-GATGGCAGTAGCTGCGCTGATA。同時以NADPH為內(nèi)參對照,引物序列為F:5’-GCCAGAGTATCACTACCTCCAC, R:5’-CTCGGAGGTAAGCCAAGAGTGT。

1.3.8Western Blot檢測VEGF表達量

液氮研磨大鼠腫瘤組織樣本,勻漿器勻漿,取適量加入100μLPBS重懸,然后加入25μL 5蛋白上樣緩沖液,混勻,沸水中作用10min,制備蛋白樣品進行SDS-PAGE,然后利用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至平PVDF膜,用5%脫脂奶粉封閉1h,一抗小鼠VEGF單克隆抗體(1:2000),4℃孵育過夜,TBST清洗5次,每次5min,然后與HRP標記的兔抗鼠IgG(1:5000稀釋)作用1h,TBST清洗5次,每次5min,然后ECL顯色。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 半枝蓮多糖不同給藥方式對HCC裸鼠瘤重的影響

給藥組降低腫瘤重量指標高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中,肝動脈灌注給藥組較口服組抑瘤率更加明顯,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1、2。

圖1 各組大鼠平均瘤重注:與模型對照組相比,***P<0.001,*P<0.05;與口服組相比,##P<0.01。

2.2 qPCR檢測腫瘤組織VEGF表達量

分別取各組腫瘤組織,液氮研磨提取RNA,反轉(zhuǎn)制備cDNA,以此為模板檢測VEGF表達量,結(jié)果顯示如圖2。對照組VEGF mRNA水平高于給藥組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);且口服組和肝動脈灌注組比較結(jié)果發(fā)現(xiàn),前者VEGF mRNA水平高于后者,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 各組肝癌組織中VEGF的mRNA的相對表達量注:與模型對照組相比,***P<0.001,**P<0.01;與口服組相比,##P<0.01。

2.3 Western blot 檢測各組腫瘤VEGF表達量

蛋白免疫印跡顯示對照組VEGF蛋白表達量顯著高于給藥組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);口服組和肝動脈灌注組比較結(jié)果發(fā)現(xiàn),前者VEGF 蛋白表達量顯著高于后者,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖3。

圖3 各組肝癌組織中VEGF蛋白表達水平注:與對照組相比,***P<0.001,*P<0.05;與口組相比,##P<0.01。

2.4 半枝蓮多糖對MVD的影響

對照組組織中MVD的平均值為(13.62±3.12)個/視野,肝動脈灌注組大鼠MVD的平均值為(7.45±1.52)個/視野,口服組MVD的平均值為(11.16±2.34)個/視野。統(tǒng)計學分析顯示,較對照組,經(jīng)肝動脈灌注半枝蓮多糖可顯著抑制肝癌組織中微血管的形成(P<0.05)。詳見圖4。

圖4 三組肝癌組織中MVD數(shù)量分析上圖為癌癥樣本組織化學分析,箭頭指示CD34陽性的微血管,400倍視野下微血管密度計數(shù);下圖為腫瘤中MVD的量化分析。注:肝動脈灌注組與對照組相比,*P<0.05。

3 討論

目前,原發(fā)性肝癌是目前發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一,在全球惡性腫瘤發(fā)病率中排第6位,其引發(fā)的死亡在腫瘤致死率中排第3位[13-14]。絕大多數(shù)肝癌血供豐富,惡質(zhì)病、轉(zhuǎn)移率高、切除復發(fā)性高等因素是影響其預后的重要原因[15-16]。肝癌組織的血管是癌細胞進行代謝的重要結(jié)構基礎,抑制血管生成相關因子如bFGF、VEGF,可以直接有效地抑制腫瘤血管的生成進而抑制腫瘤的生長,因此抑制肝癌血管生長是目前臨床治療肝癌的重要干預手段[17-18]。VEGF在增加腫瘤血管通透性、促進血管生長中具有關鍵性作用,故目前針對VEGF及其受體開發(fā)的藥物,如貝伐珠單抗、索拉非尼等在肝癌臨床治療中取得了重要應用[19]。

多糖是自然界常見的天然大分子藥物,不斷的研究發(fā)現(xiàn)多糖在抗腫瘤中起到了重要作用[20]。半枝蓮多糖是中藥半枝蓮的重要生物活性物質(zhì)之一。張秀娟團隊發(fā)現(xiàn)半枝蓮多糖可以顯著抑制S180肉瘤在體內(nèi)的生長[21],隨后有報道稱半枝蓮多糖可以抑制大鼠HepA腫瘤的生長,增強大鼠機體免疫機能[22]。于水瀾等人通過分析半枝蓮多糖干預對肝癌大鼠差異表達蛋白質(zhì)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可以調(diào)節(jié)肝癌血清中多蛋白調(diào)節(jié)實現(xiàn)對腫瘤生長的抑制[23]。但是目前,對于半枝蓮多糖對肝癌血管組織血管生長的影響還未見報道。

本研究通過建立裸鼠HCC模型,分別給予口服和肝動脈灌注的方法給予半枝蓮多糖治療,隨后對其抑瘤率、VEGF表達、肝癌組織MVD的影響進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)半枝蓮多糖可以顯著抑制裸鼠肝癌組織的生長,其中肝動脈灌注比口服取得的抑瘤效果更加明顯。VEGF的mRNA和蛋白表達水平檢測發(fā)現(xiàn)半枝蓮多糖能夠顯著降低VEGF在腫瘤組織中的表達,而且肝動脈灌注取的效果更加明顯。為了更加直觀的展示半枝蓮對腫瘤組織血管生成的影響,我們進行了免疫組織化學檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝動脈灌注半枝蓮多糖的方法取得了最佳的血管抑制效果,雖然口服半枝蓮多糖相比于對照組微血管密度有所降低,但是差異不顯著,該結(jié)果和之前的檢測基本吻合。

綜上所述半枝蓮多糖可以有效抑制肝臟組織中VEGF的表達,從而抑制肝癌組織中微血管的生成,繼而實現(xiàn)抑制肝癌的效果。肝動脈灌注半枝蓮多糖相比于口服能夠達到更佳的治療效果,為半枝蓮多糖在肝癌臨床的治療提供參考。