基于GC-MS技術和網絡藥理學方法探討那如-3味丸治療類風濕性關節炎的作用機制

額尼日勒,廖翠平,高 雅,圖 雅

(1.內蒙古民族大學蒙醫藥學院,內蒙古 通遼 028000;2. 中國中醫科學院醫學實驗中心,北京 100700;3.中國中醫科學院中醫藥發展研究中心, 北京 100700)

類風濕性關節炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一種多關節炎為主要臨床表現的自身免疫性疾病。RA病的特征是多關節、對稱性、侵襲性的關節炎,晚期多畸形、殘疾,是造成我國人群喪失勞動力和殘疾的主藥病因之一。可累及心、肺、腎等器官損傷[1]。RA發病率在0.35%左右,高發年齡段為39～59歲。該病女性的發病率要高于男性,女患者多以氣血虧損為證[1-3]。

蒙藥那如-3味丸由金色訶子、蓽茇、草烏(制)組成,味苦、性溫、氣香,本方出自《至高要方》,異名為“納如蘇木珠日”,中華人民共和國衛生部藥品標準(蒙藥分冊)[4]中也有關那如-3味丸的記載,以功能組方為溫性,治療類風濕性關節炎的良方,臨床效果佳。蒙醫臨床中,類風濕性關節炎也稱為“協日烏素癥”。

“協日烏素癥”也稱為“黃水癥”,是蒙醫分類疾病的“六基癥”之一[5]。從蒙醫基礎理論上可以將“協日烏素癥”分為寒性和熱性兩大類。“協日烏素”與血、希日熱合并則形成熱性協日烏素病,稱為“黑協日烏素病”;與巴達干、赫依之寒合并則形成“寒性協日烏素癥”[6]。“協日烏素癥”(黃水病)的病質主要為膩、銳、熱、濕、泄。關于“協日烏素癥”的產生文獻中的記錄是這樣記載的:當人們的一日三餐通過胃加工,將營養精華輸送到肝,然后演變成血,血的精華輸送到心臟,而血的糟粨到膽囊演變成膽汁,膽汁的精華演變成“協日烏素”[7]。 治療“協日烏素”癥需在調理“赫依”、“希拉”、“巴達干”三根的基礎上,使用多為溫平藥味的方劑來治療,達到扶胃,燥“協日烏素”并清熱或祛寒[2]。由于四個“亞如門德格”——“飲食、起居、時節及其他因素”的影響,上述任何一個或幾個因素失去正常狀態及相互之間的平衡關系,都會導致“協日烏素癥”發病[8]。飲食方面:食如過多的刺激性的食物,例如魚肉、動物內臟、不易消化、生冷、容易導致過敏的食物“《月光醫經》將類風濕關節炎歸屬于寒性病或寒癥,培補養血治療[8]。《蒙醫內科學》(1976年)在托列病的討論中,提到“該病多見于女性和中青年人群,以手指關節、腕關節等小關節對稱性受累為特點”等臨床表現[8]。蒙醫認為類風濕性關節炎是協日烏素偏盛、偏衰和功能紊亂而導致病變,并損及全身關節而引起的急性發病或慢性經過的一種疾病[9]。并認為類風濕性關節炎的主要發病機制是由于協日烏素增盛,與巴達干黏液和血液相搏,凝聚于關節內而阻礙氣血運行所致[3]。機體的各個組織器官都有可能發生“協日烏素癥”,包括了超敏反應性疾病、自身免疫性疾病等多種非感染性炎性疾病,也包括部分感染性疾病的中后期病變[9]。治療“協日烏素癥”的藥物以辛、苦為主,以寒、鈍、輕、糙的藥味性能居多,藥效以鈍、燥、輕為主。苦味含寒、鈍性能。能克制“協日”熱銳之主質,以達消黏、解毒、調解“赫依”、“希日”、“巴達干”三根之能。

蒙醫臨床上治療類風濕性關節炎的常用藥物有嘎日迪五味丸、文冠木十味湯(森等-10音湯)、驢血二十五味丸(額勒吉根·齊素-25)、苦參三味湯(道格勒·額布蘇-3音湯)等[10]。

因此本研究采用GC-MS方法對那如-3味丸揮發油成分進行分析,并應用網絡藥理學預測其治療類風濕性關節的活性成分和作用靶點,為闡明那如-3味丸預防或治療類風濕性關節炎的藥效物質及作用機制提供數據支撐。

1 材料

1.1 藥材

蒙藥那如-3味丸購買內蒙古通遼附屬醫院。

1.2 儀器與試劑

7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀(美國Agilent公司);XS105DU型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司);FA2204B型電子天平(上海精密科學儀器有限公司);98-1-B型電子調溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司);水為娃哈哈純凈水;環己烷(天津大茂化學試劑廠,批號20201010)。

1.3 數據庫及軟件

中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP,https://tcmspw.com/index.php);Swiss Target Prediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/);PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/);UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/);在線人類孟德爾遺傳數據庫(OMIM,http://www.omim.org/);KEGG數據庫(http://www.kegg.jp/);GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/);DAVID 6.8數據庫(https://david.ncifcrf.gov/);imageGP平臺(http://www.ehbio.com/ImageGP/);蛋白結構數據庫(PDB,http://www.rcsb.org/);Cytoscape 3.9.0軟件和Discovery Studio 2019軟件。

2 方法

2.1 那如-3味丸揮發油的提取

取那如-3味丸1.0 kg,置于10000mL圓底燒瓶,加入蒸餾水10L連接揮發油測定器與冷凝管。置電熱套中緩慢加熱至沸,并保持微沸約6 h,至測定器中油量不再增加,停止加熱,放置片刻,收集那如三味丸,得淡黃色透明的油狀液體,取那如三味丸丸揮發油100μL加環己烷定容至1 mL量瓶,經0.45μm微孔濾膜過濾,即得供試品溶液。

2.2 GC-MS分析

2.2.1色譜條件

HP-5MS色譜柱(0.25mm×30mm,0.25μm)。初始溫度為50℃,以16℃·min-1升溫至130℃,以1℃·min-1升溫至135℃,保持5min;以3℃·1min-1升溫至150℃,保持3min;再以5℃·min-1升溫至210℃。分流比10:1,進樣體積0.4μL,載氣為He,載氣量1.0mL·min-1。

2.2.2質譜條件

EI檢測器,電離電壓70eV,離子源溫度230℃,傳輸線溫度260℃,四極桿溫度150℃。掃描質量范圍m/z50～500,溶劑延遲1.0min。

2.3 那如-3味丸揮發油化學成分的鑒定

經GC-MS測那如-3味丸揮發油,得到樣品的總離子流圖。通過檢索比對NIST數據庫,鑒定那如-3味丸揮發油樣品中的化學成分,并計算各化學成分的含量。

2.4 基于“活性成分-靶點-通路”的網絡藥理學分析

2.4.1那如-3味丸成分選擇及其作用靶點預測

中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP, http://tcmspw.com/index.php)和SwissTargetPredicition數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/),分別輸入那如-3味丸的有效成分,以口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和藥物相似性(drug-likeness,DL)≥0.18為條件篩選,得到各藥的活性成分。并通過pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查找Canonical SMILES、InChIKey和CAS號為后續工作做準備。

2.4.2治療類風濕性關節炎疾病靶點的搜集

以“Rheumatoid Arthritis,RA”為關鍵詞,檢索3個疾病靶點數據庫(OMIM、GeneCards、KEGG),以相關性得分(relevance score)>1為標準,得到類風濕性關節炎相關的作用靶點。通過Uniport數據庫將靶點蛋白信息轉化為Uniport ID,去除重復靶點基因,利用Venny數據庫取那如-3味丸的揮發油的活性成分靶點與RA疾病靶點交集,獲得那如-3味丸的作用靶點。

2.4.3生物通路富集分析

將“2.4.2”搜集到的潛在靶點輸入DAVID數據庫,選擇物種為“Homo Sapiens”,進行GO注釋分析,其中GO分析包括生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、及細胞組分(cellular component,DC)。保存其結果,并通過imageGP平臺對結果可視化。選取有統計學意義(P<0.05)的所有通路。根據相關文獻篩選得到直接或間接與類風濕相關的通路。

2.4.4“活性成分-靶點-通路”網絡構建與分析

將那如-3味丸的成分、類風濕性關節炎的靶點數據導入Cytoscape 3.9.0軟件,構建那如-3味丸治療類風濕性關節炎的“活性成分-靶點-通路”網絡。利用“Network Analysis”功能計算網絡拓撲參數,導出介度值、中心度值、度值等參數,度值>平均值的成分可能是那如-3味丸治療類風濕性關節炎的潛在活性成分。

2.4.5分子對接

根據網絡的拓撲分析選取成分中degree較大且含量較高的12個那如-3味丸的主要成分依次與10個核心治療靶點對接,在PubChem數據庫下載活性成分的3D結構,在PDB數據庫下載靶點的蛋白結構,采用Discovery Studio2019軟件進行分子結構常規預處理,去除水分子,加氫后進行力場優化。導入成分配體選擇LibDock對接模式,記錄受體與配體的對接分數。

3 結果

3.1 那如-3味丸揮發油化學成分的鑒定

使用水蒸氣蒸餾法提取那如-3味丸干燥心材的揮發油,通過GC-MS對揮發油進行分析,其總離子流色譜圖(TIC)見圖1。通過檢索比對NIST數據庫,共分離鑒定出那如-3味丸樣品中56中化學成分,結果見表1。

表1 那如-3味丸揮發油中化學成分的氣質鑒定

圖1 那如-3味丸丸揮發油氣質分析的TIC

3.2 靶點預測

通過中藥系統藥理學數據庫和分析平臺;SwissTargetPredicition數據庫預測得到630個成分靶點,利用OMIM、GeneCards 數據庫查詢類風濕疾病的相關靶點信息,得到2693個疾病靶點。

3.3 相關靶點的GO功能和KEGG通路富集分析

GO功能注釋是通過BP、MF、 CC對基因進行注釋和分類(圖2A～C)。在BP中信號傳導,蛋白質磷酸化占比例較高;在CC中細胞膜、細胞質的占比例較高;在MF中蛋白結合、ATP結合較高。為了進一步確定靶點的生物能,進行KEGG通路分析,取有統計學意義的(P<0.05)的通路,根據文獻篩選得到16個類風濕相關的通路,如PI3K-Akt信號、MAPK信號通路和Ras信號通路等,見圖2D。

A.BP;B.CC;C.MF;D.KEGG圖2 那如-3味丸治療類風濕性關節炎相關靶蛋白的GO注釋功能富集分析及KEGG通路分析

3.4 “活性成分-靶點-通路”網絡分析

在輸出的網絡中,以不同顏色的節點表示活性成分、靶點及作用通路,紅色菱形節點代表活性成分,藍色菱形節點代表作用靶點,而藍色方形節點代表作用通路,見圖3。對網絡進行拓撲分析,節點大小與連接度(degree)呈正相關,以節點中介中心性大于中位數0.006,節點緊密度大于中位數0.353,degree大于2倍中位數6,篩選得到前列腺素內過氧化物合酶(prostaglandin-endoperoxide synthase 2)、受體激酶插入域(Kinase insert Domain Receptor)等10個核心靶點,見表2。對網絡中那如-3味丸的53個活性成分根據degree排序,其中degree大于2倍中位數6且含量較高(峰面積百分比大于1)的活性成分為A-曲乳酰胺、乙酰丁香酚等,見表3。對網絡中9個通路中degree較高的通路為PI3K-Akt信號、MAPK信號通路和Ras信號通路等,見表4。

表2 那如-3味丸丸治療偏頭痛的核心靶點

表3 那如-3味丸治療類風濕性關節炎相關成分的網絡參數

表4 那如-3味丸調控的類風濕性關節炎關信號通路

圖3 那如-3味丸治療類風濕性關節炎的“活性成分-靶點-通路”網絡注:方塊為核心靶點,圓圈為活性成分成分,菱形為關鍵通路

3.5 分子對接結合

選取“活性成分-靶點-通路”網絡中degree值較大且含量較高的11個主要成分和10個核心靶點進行分子對接,對接分數見表5。結果表明反式戊烯醇乙酸酯 、A-曲乳酰胺可與靶點JAK2發生相互作用且對接分數較高;二氯甲烷可與7個核心靶點發生較高的對接,則血小板衍生生長因子受體β、胞內磷脂酰肌醇激酶和前列腺素內過氧化物合酶靶點對任一成分沒有對接,其推測那如-3味丸揮發油成分主要通過上述7個靶點發揮著預防或治療類風濕性關節炎的作用。選取打分最高的成分與靶點進行分析,其對接結果見圖4。結果表明反式戊烯醇乙酸酯與JAK2發生相互作用。

表5 那如-3味丸活性成分與關鍵靶點蛋白的對接打分

圖4 反式戊烯醇乙酸酯與JAK2的分子對接

4 討論

網絡藥理學是基于系統生物學理論,通過“多成分-多靶點-多途徑” 構建多層次的網絡,用于探索疾病與藥物之間的相關性,為預測藥物作用機制的新策略[11]。運用網絡藥理學的方法初步預測了那如-3味丸揮發油類成分治療類風濕性關節炎的作用機制。為進一步探討那如-3味丸揮發油治療類風濕性關節炎的作用機制,本研究構建“成分-靶點-疾病”網絡篩選其可能的作用靶點,得到那如-3味丸揮發油治療類風濕性關節炎的10個核心基因為PTGS2、JAK2、MAPK1、AKT1、PIK3CD、MAKP8、JAK1、IKBKB、PDGFRB。PTGS2又稱環氧合酶2(COX-2),是一種跟炎癥反應相關的酶,在細胞中可被促炎細胞因子和生長因子等高度誘導,從而參與炎癥反應、細胞增殖、細胞凋亡等多種病理過程。非甾體抗炎藥可通過抑制COX-2,阻止前列腺素的合成達到抗炎解熱鎮痛的作用[12-13]。JAK1、JAK2是JAK 蛋白酪氨酸激酶家族的成員,JAK1能夠對細胞因子IL-2、IL-6、IL-10進行應答,JAK2基因的突變可導致真性紅細胞增多增,特發性血小板增多癥、特發性骨髓纖維化。研究表明,JAK2已成為治療和預防類風濕性關節炎發生的確切靶點[14]。MAPK1、MAPK8 是MAPK家族成員,在控制炎癥反應和免疫反應的誘導和調節中具有重要作用[15]。MAPK1 在 MAPK/ERK 級聯中起著重要作用,介導著細胞生長、黏附、存活和分化等多種生物學功能。AKT1 作為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶之一,研究表明AKT1與自噬性死亡有關[16]。IKBKB基因病理性突變會引起一種免疫表型特殊的聯合免疫缺陷病[17]。

對關鍵靶點進行KEGG通路富集分析探究其信號通路中的作用,結果發現那如-3味丸可能通過調控PI3K-ATK、MAKP、RAS、Clacium、PD-L1、JAK-STAT、FoxO、VEGF、mTOR、TNF信號通路等揮發抗類風濕性關節炎的作用。PI3K-ATK信號通路與類風濕性關節炎存在一定關聯性。PI3K-ATK信號通路被認為是成纖維樣滑膜細胞(FLS)增殖與凋亡失衡發生的橋梁,并且被認為作為媒介介導RA滑膜炎的發展[18]。MAPK信號通路在類風濕性關節中發揮著重要作用,此信號通路的過度活化與滑膜組織炎性增生與其關節軟骨組織破壞密切相關,一直以來被認為是用以治療類風濕性的前途靶點[19-20]。RAS信號通路作為類風濕性關節炎易敏感點,在類風濕性關節發生、發展過程中意義重大[21]。RAS信號通路的激活介導了類風濕性關節炎的FLS細胞的異常激活及關節骨及軟骨的破壞侵蝕。Ras/Raf1信號通路在類風濕關節炎中表達上調,并促進類風濕關節的進展[22]。研究表明,抑制RAS信號通路的活化有助于緩解類風濕性關節炎的骨破壞,可改善類風濕性關節炎的病情[21]。PD-L1信號通路是機體免疫系統的強大調節劑,可通過抑制次信號通路活化T細胞的增殖和分化,從而阻止自身免疫性疾病的發生。PD-L1在類風濕性關節炎等免疫性疾病中表達下調,可以作為靶點的免疫治療可緩解自身免疫的炎癥狀態。為治療免疫性疾病的防御與治療提供新的策略[23]。JAK-STAT是多種細胞的生長、活化、分化、凋亡及其功能發揮過程中重要的信號通路[24]。研究表明[25],JAK和STAT1、SOCS3在正常人或關節炎病人滑膜中表達很少表達。在類風濕性關節炎患者滑膜組織中表達較高。可經過抑制此信號通路,在臨床上為患者提供新的治療方案。VEGF是一種極為重要的促血管生成因子,可以與滑膜血管內皮上的受體結合,促進滑膜血管的新生,增加血管通透性和炎性因子的釋放[26]。文獻表明,類風濕性關節炎局部組織PI3K/AKT/mTOR通路被激活,使細胞維持穩定的功能下降,細胞凋亡增加而使結構與功能受到破壞,抑制PI3K/AKT/mTOR通路可有效改善類風濕性關節炎癥狀[27]。TNF可以激活免疫細胞和內皮細胞,導致炎癥介質的釋放,如白細胞介質、血小板活化因子等。并且調節細胞因子的產生和分泌,從而影響免疫細胞的功能和免疫反應。本文篩選得到的通路和文獻報道的類風濕重要通路較為一致。為深入闡釋那如-3味丸揮發油治療類風濕性關節炎作用機制提供依據。

綜上所述,本研究基于GC-MS技術定性表征那如-3味丸揮發油的化學成分,并結合網絡藥理學與分子對接篩選及驗證,其初步探討了那如-3味丸揮發油治療類風濕性關節炎的潛在作用機制,為進一步闡明那如-3味丸的治療類風濕性關節炎機制提供了一定的研究方向和數據支持。