糖尿病陰證大鼠創面模型的制備

周佳俞，陳麗，康瀚云，丁雅容，王巍，袁忠行，雷嘉欣，周忠志

（1. 湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208； 2. 湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007）

糖尿病及其并發癥已成為嚴重影響人類健康的全球性公共衛生問題之一，國際糖尿病聯盟（IDF）統計顯示，截至2021年我國糖尿病患者超過1.4億人，其中糖尿病創面發病率高達20%［1］，給家庭和社會帶來了沉重負擔。糖尿病創面多發展為慢性難愈性創面，患者患病日久、體弱納差、創面色澤晦暗、生長遲緩、遷延難愈，中醫辨證為“陰證”范疇［2］。為了進一步探究糖尿病創面的病因病機與治療方法，建立穩定的高質量動物模型是當務之急。目前制備糖尿病、陰證等動物模型的方法多樣［3-4］，但仍然存在造模方法不統一、模型不穩定、可重復性不高等問題。本實驗針對糖尿病創面特點并結合前期研究基礎建立糖尿病陰證創面動物模型，從動物體征、創面病理改變等角度進行評價，意在對相關模型的建立提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠（湖南中醫藥大學實驗動物中心），36 只，體質量180～200 g。飼養條件：溫度22 ℃左右，相對濕度40%～60%，每12 h 光照、黑暗交替，獨立通風系統（IVC），3 只一籠。實驗動物質量合格證號：1107272011007366；實驗動物生產許可證號：SYXK（湘）2019－0004；實驗單位使用許可證號：SYXK（湘）2019－0009；本研究已通過湖南中醫藥大學實驗動物倫理審查委員會審批，批準號：LL2020071401。

1.1.2 主要試劑

高脂乳劑組成：精制豬油（產品標志號：GB/T8937）；6－正丙基－2－硫代尿嘧啶（上海源葉生物科技有限公司，貨號：530643）；膽酸鈉（上海源葉生物科技有限公司，貨號：S30219）；膽固醇（北京索萊寶生物科技有限公司，貨號：C8280）；吐溫－80（北京索萊寶生物科技有限公司，貨號：T8360）；1，2－丙二醇（北京索萊寶生物科技有限公司，貨號：YZ－190001）。SPF 級大小鼠維持飼料（華阜康公司，貨號：1022）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（北京索萊寶生物科技有限公司，貨號：S8050）；0.1%檸檬酸鈉緩沖液（北京索萊寶生物科技有限公司，貨號：C1013）；戊巴比妥鈉（西格瑪奧德里奇貿易有限公司，貨號：11715）；氫化可的松（上海源葉生物科技有限公司，貨號：B61935）；蘇木素、伊紅、返藍液（塞維爾生物科技有限公司）。

1.1.3 主要儀器

微單相機［索尼（中國）有限公司］；切片機、顯微鏡（徠卡公司）；數字切片掃描系統（3DHISTECH 公司）；YK－8 生物組織攤烤片機（湖北耀楚醫療器械科技有限公司）。

1.2 分組與模型建立

36 只SD 大鼠，隨機分為正常創面組、糖尿病創面組和糖尿病陰證創面組。適應性喂養后給予充足飲食，除正常創面組外，其余兩組大鼠連續14 d灌胃高脂乳2 mL/d［5］，選擇一次性腹腔注射50 mg/kg STZ-檸檬酸鈉混合液，同期正常創面組大鼠灌胃飲用水、腹腔注射生理鹽水。尾靜脈采血測定大鼠血糖值，若血糖值連續3 d ≥ 16.7 mmol/L，并糖耐量試驗陽性，則認為糖尿病造模成功。

糖尿病陰證創面組大鼠按2 mL/kg劑量，連續7 d左右腿交替肌內注射氫化可的松注射液，其余組注射等量生理鹽水。若大鼠創面滲液清稀、肉色灰暗，表現出喜靜懶動、納差便溏、體質量減低等陰證癥狀，則認為糖尿病陰證造模成功。造模成功后第1 天各組大鼠麻醉后備皮、消毒，然后在背部裸區距正中線1.5 cm處，手術構建全層皮膚缺損創面，術后置于電熱毯保溫，若術后及時恢復活動，3 d未出現死亡，則認為創面造模成功。

1.3 觀察指標

1.3.1 一般情況

以3 d 為周期測量并記錄每只大鼠體質量、飲食、飲水、隨機血糖。

1.3.2 糖耐量檢測

口服糖耐量（OGTT）試驗：隨機選取每組大鼠各10 只，禁食不禁水過夜，然后給予50%葡萄糖溶液（2 g/kg）灌胃，分別于灌胃后0、30、60、120 min 測量大鼠尾靜脈血血糖值。

1.3.3 創面愈合情況

肉眼觀察各組大鼠的創面顏色、創面形狀、腫脹程度、滲液量、皮膚收縮情況。在造模后、第7、14 天放置標尺于創面相機拍照，并使用Image J 圖像分析軟件獲取創面面積數據，計算愈合面積所占百分比（A）。

A（%） = （造模前創面面積-造模后創面面積）/造模后創面面積 × 100%

1.3.4 病理形態觀察

處死后取材皮膚組織、胰腺檢測。脫水、包埋、切片、脫蠟、HE 染色、中性樹脂封片，使用3DHISTECH SlideViewer系統閱片并拍攝圖片。

1.3.5 臟器指數

大鼠取材時選取腎、脾、腎上腺、胸腺，稱濕重，用取材時體質量計算器官體質量分數并進行統計學處理。

1.4 統計學方法

使用SPSS 26.0 軟件進行統計學處理。計量資料以均數 ± 標準差（±s）表示，運用ANOVA單因素方差分析方法。P< 0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠成模率、死亡率統計

動物飼養與灌胃期間，大鼠健康活潑，狀態良好，糖尿病造模后血糖不達標大鼠1 只，陰證造模后飼養后期，因虛弱死亡大鼠1 只，均予剔除數據。糖尿病創面組與糖尿病陰證創面組造模成功率均為91.7%。結果見表1。

表1 造模成功率及失敗原因

2.2 飲食、飲水、體質量情況比較

實驗期間大鼠的體質量、飲食飲水量緩慢增長。糖尿病造模后，糖尿病創面組、糖尿病陰證創面組大鼠較正常創面組出現明顯的多飲多食現象，差異有統計學意義（P< 0.05），創面造模后糖尿病創面組比糖尿病陰證創面組變化更顯著（P< 0.05）；正常創面組大鼠體質量持續增長，糖尿病創面組和糖尿病陰證創面組大鼠于創面造模后體質量明顯下降，低于正常創面組大鼠（P< 0.05），其中糖尿病陰證創面組較糖尿病創面組降幅更大（P< 0.05）。結果見圖1～圖3。

圖1 各時間點不同組別大鼠飲食量變化趨勢折線圖

圖2 各時間點不同組別大鼠飲水量變化趨勢折線圖

圖3 各時間點不同組別大鼠體質量變化趨勢折線圖

2.3 血糖

糖尿病造模前，3 組大鼠隨機血糖濃度均屬正常范圍，血糖值低于16.7 mmol/L。糖尿病造模后，糖尿病創面組與糖尿病陰證創面組大鼠血糖濃度明顯高于正常創面組（17.1～26.2 mmol/L），差異有統計學意義（P< 0.05）。結果見圖4。

圖4 各時間點不同組別大鼠血糖變化趨勢折線圖

2.4 OGTT試驗測定結果

OGTT 試驗結果表明，正常創面組、糖尿病創面組及糖尿病陰證創面組在未給予葡萄糖負荷前，均表現為非高血糖狀態（ < 13.6 mmol/L）。給予葡萄糖負荷后，正常創面組血糖出現上升且在30 min達到高峰，而后逐步下降，全程未出現高血糖狀態。而糖尿病創面組及糖尿病陰證創面組血糖值高居不下，血糖清除明顯減緩，30、60、120 min均高于正常創面組且表現為高血糖狀態，差異有統計學意義（P< 0.01）。以上結果說明，糖尿病創面組及糖尿病陰證創面組大鼠存在胰島素抵抗。結果見圖5。

圖5 OGTT試驗不同時間點各組平均血糖曲線

2.5 臟器指數

取材后，糖尿病陰證創面組大鼠腎臟、脾臟、腎上腺、胸腺臟器指數均低于其余兩組，差異有統計學意義（P< 0.05，P< 0.01）；糖尿病創面組各類臟器指數高于正常創面組，差異有統計學意義（P< 0.05）。結果見表2和表3。

表2 各組7 d臟器指數比較（ ± s，%）

表2 各組7 d臟器指數比較（ ± s，%）

注：與正常創面組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與糖尿病創面組比較，##P < 0.01。

組別正常創面組糖尿病創面組糖尿病陰證創面組F值P值n6 5 5臟器指數/%腎臟0.604 ± 0.018 0.730 ± 0.014**0.594 ± 0.032##58.694 0.000脾臟0.256 ± 0.010 0.287 ± 0.017**0.245 ± 0.015##11.897 0.001腎上腺0.315 ± 0.022 0.345 ± 0.022*0.299 ± 0.021**5.523 0.018胸腺0.190 ± 0.004 0.195 ± 0.005 0.187 ± 0.004*4.602 0.031

表3 各組14 d臟器指數比較（ ± s，%）

表3 各組14 d臟器指數比較（ ± s，%）

注：與正常創面組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與糖尿病創面組比較，#P < 0.05，##P < 0.01。

組別正常創面組糖尿病創面組糖尿病陰證創面組F值P值n 6 6 6臟器指數/%腎臟0.644 ± 0.030 0.761 ± 0.021**0.609 ± 0.015*##72.425 0.000脾臟0.263 ± 0.012 0.289 ± 0.008**0.244 ± 0.009**##32.310 0.000腎上腺0.338 ± 0.046 0.407 ± 0.066*0.251 ± 0.044**#13.051 0.001胸腺0.176 ± 0.005 0.196 ± 0.009**0.139 ± 0.005**##105.000 0.000

表4 各組不同時間大鼠創面愈合率比較（ ± s，%）

表4 各組不同時間大鼠創面愈合率比較（ ± s，%）

注：與正常創面組比較，**P < 0.01；與糖尿病創面組比較，##P < 0.01。

組別正常創面組糖尿病創面組糖尿病陰證創面組F值P值第7天創面數量24 22 22愈合率及統計量0.783 ± 0.065 0.610 ± 0.107**0.501 ± 0.083**##62.473 0.000第14天創面數量12 12 12愈合率及統計量0.908 ± 0.039 0.853 ± 0.041**0.745 ± 0.053**##40.944 0.000

2.6 創面形態觀察

正常創面組在第7 天創面干凈，痂皮縮小且較薄；第14天，創面殘存少許痂殼，基本修復。糖尿病創面組在第7天創面有痂皮形成，出現流膿滲血；第14天，創周痂皮基本干燥，修復趨勢明顯，上述各時間點與正常創面組比較，愈合效果差，差異有統計學意義（P< 0.01）。糖尿病陰證創面組在第7天，創面干燥，痂皮完整，創周有明顯收勢；第14天，創面色澤晦暗污穢，修復遲緩，各時間點與正常創面組、糖尿病創面組比較，愈合效果更差，差異有統計學意義（P< 0.01）。見圖6～圖7。

圖6 各時間點大鼠創面肉眼觀圖

圖7 各組創面愈合率情況比較

2.7 病理切片HE染色

2.7.1 皮膚組織

造模后第7 天：正常創面組創緣平整且薄，創面被新生肉芽組織覆蓋，組織結構清楚（圖8A1），肉芽組織和毛細血管較豐富，可見豐富細密而平行排列的膠原纖維（圖8A2）；糖尿病創面組生長緩慢，創面尚未有新生組織填充，創緣結構紊亂，痂皮、表皮層脫落（圖8B1），新生細胞少，炎細胞浸潤明顯（圖8B2）；糖尿病陰證創面組生長遲緩，有厚重痂皮覆蓋（圖8C1），邊緣可見纖細的膠原纖維向中央爬行（圖8C2）。

圖8 創面病理形態觀察（HE，× 20，× 100）

造模后第14 天：正常創面組表皮層出現且表面平整，各層組織細胞排列有序（圖8A3），粗壯的膠原纖維排列整齊，填滿缺損，炎細胞消退，肉芽組織趨于成熟，甚至可見毛囊生發，創面基本愈合（圖8A4）；糖尿病創面組皮膚組織肥厚，分泌物堆積，中間缺失（圖8B3），可見明顯的肉芽組織生長、爬行趨勢，結構層次較紊亂，膠原排列疏松且不規則，伴有少量炎細胞浸潤，表皮層尚未形成（圖8B4）；糖尿病陰證創面組可見全層皮膚較前兩組薄，出現不連續的新生表皮覆蓋，表皮生長不平整，尚未完全填充創面（圖8C3），創面中成纖維細胞數量多，有炎細胞浸潤，細胞排列紊亂（圖8C4）。

2.7.2 胰腺

造模后第7 天：正常創面組大鼠胰腺組織肥厚、完整，胰島數量多，呈類圓形，胰島β細胞呈索狀排列，細胞大小一致，細胞顆粒淡染，核染色質清晰，胞漿界線清楚（圖9A1）；而糖尿病創面組大鼠胰腺組織萎縮，胰島處于逐漸消失狀態，胰島邊界模糊，胞漿有空泡形成（圖9B1）；糖尿病陰證創面組胰島邊界消融，胰島β 細胞排列緊密（圖9C1）。

圖9 胰腺病理形態觀察（HE染色，× 400）

造模后第14 天：正常創面組大鼠胰腺組織愈加肥厚，胰島多且大（圖9A2）；糖尿病創面組大鼠胰島縮小甚至消失，β細胞皺縮，溶界消失（圖9B2）；糖尿病陰證創面組胰島邊界不均，排列稀疏，細胞核淡染，出現大量空泡（圖9C2）。

3 討論

全球糖尿病患者約4.63 億，其中難愈合創面并發率高達20%［1］，嚴重危害人類健康，給社會和家庭帶來沉重負擔。糖尿病慢性創面臨床過程中常出現創面平塌、色澤灰白、滲液清稀、神疲乏力、生肌長肉遲緩等表現，有纏綿難愈、易于復發的特點，屬于“陰證”范疇，嚴重時成為“脫疽”。中醫學采用箍圍、熏洗等外治方法治療糖尿病并發癥取得了良好的治療效果［6-7］。糖尿病遷延日久，陽氣虛衰，溫煦推動失職，氣血瘀滯，而氣血不達肌表，阻礙新肉化生，創面遷延難愈［8］。這與糖尿病狀態下機體代謝功能減弱、生長減緩等因素相符，創面特征為愈合受損、炎癥延長和上皮化動力學降低［9］。因此，本實驗模擬糖尿病慢性創面患者臨床特征，制備糖尿病陰證創面大鼠模型，觀察動物疾病特征、創面發展現象，建立合適的動物模型，并提供實驗依據。

目前建立糖尿病大鼠模型的有效方法是使用胰島細胞特異性毒性藥物STZ 破壞胰島細胞，通過影響胰島素基因的表達轉錄翻譯，直接減少胰島素分泌，同時針對胰島細胞對氧化應激不耐受的特性，STZ 直接誘導可造成胰島細胞DNA 斷裂，造成胰島細胞功能障礙并死亡，胰島形態破壞［10］。當前，注射STZ主要包括腹腔、肌肉、尾靜脈注射等方法，其中，腹腔注射因操作簡單、傷害小，且能有效避免因推注造成的血容量增長過快所致的心衰問題，成為目前主要的給藥方式［11］。研究表明，高脂飲食可以引起糖脂代謝異常，影響胰島素信號傳導等途徑，降低胰島素敏感性，從而誘發胰島素抵抗造成肥胖基礎，之后采用高脂飲食配合高濃度高劑量單次注射STZ破壞胰島是成功制備糖尿病大鼠模型的有效方法［12］。

陰證模型主要通過免疫抑制進行誘導，包括物理射線照射、注射免疫抑制劑等方法［13］，其中通過大劑量注射糖皮質類激素誘導的陰證模型所表現出的蜷縮、皮溫下降、大便溏稀、創面局部晦暗、膿液清稀，肉芽紅而不澤等表現與糖尿病創面患者臨床表現更為相似［14］。糖皮質激素在局部穩態、細胞發育和免疫細胞激活中具有重要的生理作用［15］，而糖皮質激素過度使用會通過誘導淋巴細胞死亡并抑制免疫細胞的各項功能而發揮免疫抑制作用，從而影響胸腺、脾臟等免疫器官；并通過下丘腦－垂體－腎上腺軸（hypothalamicpituitary－adrenal axis，HPA）影響內分泌、消化系統［16-19］，對大鼠造成全身改變，如喜靜怠動、納差便溏、形體消瘦等。這些表現與中醫理論中陰證特點相符合，且病理機制與脾、腎等臟腑密切相關［20］?，F代研究認為，HPA 的功能障礙是陽虛的病理基礎，同時臟器指數降低說明造模后HPA 調節紊亂，脾、腎等功能下降［21-22］。此外，糖皮質激素直接影響物質代謝，通過抑制外周組織對葡萄糖的利用、加劇糖尿病，促進蛋白質分解同時抑制蛋白質合成、促進脂肪分解，減少細胞能量供應，造成大鼠體質量下降，消化吸收功能減弱［23］。糖皮質激素甚至存在阻礙創面皮膚愈合、導致皮膚萎縮的副作用［24］。

針對創面模型的制備，主要有全層皮膚切除術［25］、皮膚磁片壓迫法［26］、高溫燙傷法［27］等，實驗過程中發現打孔器難以穿透皮膚或造成創面位置不統一；皮膚磁片壓迫法、溫度誘導法操作難度大、創面深度及面積不可控，且大鼠溫度耐受不同，綜上本實驗選擇了直接手術法。

本實驗結果表明，糖尿病造模后的大鼠陰證癥狀突出，表現為毛發粗糙雜亂，二便劇增，氣味烘臭、毛發黯淡污穢、行動遲緩、蜷縮畏寒、大便溏稀等。與正常創面組比較，糖尿病陰證創面組與糖尿病創面組大鼠血糖明顯升高（P< 0.05），維持在17.1～26.2 mmol/L；OGTT 試驗結果提示，糖尿病陰證創面組及糖尿病創面組大鼠存在胰島素抵抗。相較于正常創面組，糖尿病陰證創面組與糖尿病創面組表現出糖尿病多飲、多食、體質量減輕等癥狀（P <0.05）。糖尿病陰證創面組大鼠腎臟、脾臟、腎上腺、胸腺臟器指數低于其余兩組，糖尿病創面組各類臟器指數高于正常創面組（P<0.05）。HE 染色結果表明，正常創面組大鼠胰腺組織肥厚，胰島完整，而糖尿病陰證創面組與糖尿病創面組胰島邊界模糊，β 細胞消融；第14 天較第7 天胰腺組織消融更明顯。創面修復情況顯示：糖尿病陰證創面組相較于糖尿病創面組、正常創面組修復速度明顯緩慢，第7、14天時間點創面愈合率均更低（P< 0.01）。且糖尿病陰證創面組HE 切片染色可見全層皮膚較前兩組薄，出現不連續的新生表皮覆蓋，表皮生長不平整，創面中成纖維細胞數量多，有炎細胞浸潤，細胞排列紊亂。綜上所述，本實驗建立的大鼠糖尿病陰證創面模型確有依據且符合中醫辨證思路。本研究在取材過程中發現糖尿病陰證創面組大鼠脾、腎萎縮顯著，有別于其他組，今后有望從此著手深入探究脾腎陽虛模型機制。

目前已有大鼠糖尿病創面模型［13］、小鼠糖尿病陰證創面模型［5］等相關研究，方法均為分步依次造模。但是大鼠糖尿病陰證創面模型各步驟造模方法尚未統一，模型效果也存在差距，影響了相關實驗的穩定性與可重復性。本團隊所采用的通過2 mL 高脂乳劑灌胃14 d 后，予以一次性腹腔注射50 mg/kg STZ－檸檬酸鈉混合液聯合2 mL/kg 肌內注射氫化可的松注射液7 d 后行創面手術，可建立穩定高效的糖尿病陰證大鼠創面模型。同時探索出制備符合中醫陰證證候的糖皮質類激素的適宜濃度與注射方法，提高了糖尿病大鼠陰證創面的穩定性和可重復性，具有一定的推廣意義。