丹霞梧桐組織培養技術研究*

易禮江 榮道軍 羅勇志 楊秀蘭

（1.廣東省沙頭角林場，廣東梧桐山國家森林公園管理處，廣東 深圳 518004；2.廣州林芳生態科技有限公司，廣東 廣州 510520）

丹霞梧桐(Firmiana danxiaensis)為梧桐科(Sterculiaceae) 梧桐屬(Firmiana) 落葉小喬木，是廣東省特有種，局限生長于韶關市丹霞山自然保護區以及南雄市全安鎮蒼石寨的丹霞崖壁上，是國家Ⅱ級重點保護野生植物[1]，在《中國物種紅色目錄》第一卷評估中被列為極危(CR)等級[2]，2012 年被列入《全國極小種群野生植物拯救保護工程規劃(2011-2015 年)》。丹霞梧桐樹形優美，花序長達30 cm,花序軸、花梗和花均為紫紅色，是值得推廣栽培的庭園觀賞樹木[3-4]。目前國內外關于丹霞梧桐的研究報道較少，主要集中在丹霞梧桐群落的地理區系成分分析[5]、空間分布微地貌環境特征[6]以及遺傳多樣性[7-8]等方面。

丹霞梧桐由于其種子種殼堅硬，在自然生境中繁殖力較低，種群競爭力較弱，造成野生資源貯藏量極其稀少，資源瀕臨滅絕，且鮮有人工栽培種植。因此，研究丹霞梧桐種子的組培快繁技術進而培育其種苗對保護和利用丹霞梧桐種質資源具有重要意義。本試驗通過機械損傷處理丹霞梧桐種子剝掉外殼，再用適宜的培養基進行誘導發芽，以期找到丹霞梧桐快繁的實驗方法技術，為丹霞梧桐的保護和解除瀕危提供科學依據及技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料分別取自廣東韶關南雄的丹霞梧桐種子培育苗的苗木頂芽或嫩莖。

1.2 試驗方法

建立體細胞無性系通常有兩種途徑：一是從外植體上直接分化出不定芽；二是從外植體誘導愈傷組織，再從愈傷組織誘導出不定芽和根，對于多數植物來講，種子和莖節作為外植體是比較普遍的，也有部分外植體可采用葉片，因丹霞梧桐的葉片無法誘導不定芽，所以本次試驗以收集種子和小苗育種出的嫩莖作為外植體進行培養。1.2.1 不同外植體處理方法

外植體接種：取出丹霞梧桐光滑的種子進行人工破壁后，用0.1%氯化汞或15%次氯酸鈉進行常規消毒處理8 min，隨后無菌水沖洗4~6 次，在無菌條件下自然風干后進行外植體的接種，并觀察外植體頂芽及內莖長勢。

外植體消毒：將需要的外植體材料陽光下曬2~3 d，再用消毒后的剪刀取頂芽或嫩莖用75%的酒精棉擦拭干凈表面的灰塵和多余的皮屑，無菌水沖洗3~4 次后，用0.1%升汞分別消毒4、3、1 min，期間用無菌水各沖洗一次。

1.2.2 不同濃度激素處理丹霞梧桐種子

丹霞梧桐種子預培養：將消毒完畢的種子在超凈工作臺上自然風干后接入MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.5 mg/L.MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+ 活性炭0.5 g/L+ 椰子汁100 mL/L.MS+6-BA1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L 糖30 g/L+瓊脂5 g/L。以不加激素的MS培養基為對照，在不同的培養基中進行預培養14 d。

丹霞梧桐種子繼代培養：將預培養的小苗轉接到MS+6-BA1.0mg/L+GA0.5mg/L.MS+6-BA0.5mg/L+GA0.5 mg/L.MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.3 mg/L 及分別加有0.5 mg/L 的活性炭作對照組，進行愈傷組織和不定芽的誘導。

丹霞梧桐種子繼2~3 代培養：繼1 代生長旺盛的苗轉接到MS+6-BA(0.5、1.0、1.5)mg/L+GA0.5 mg/L.MS+6-BA1.0 mg/L+GA(0.1、0.3、0.4)mg/L.1/2MS+6-BA(0.5、1.0、1.5)mg/L+GA0.5 mg/L.1/2MS+6-BA1.0 mg/L+GA(0.1、0.3、0.4)mg/L.1/4MS+6-BA(0.5、1.0、1.5)mg/L+GA0.5 mg/L.1/4MS+6-BA1.0 mg/L+GA(0.1、0.3、0.4)mg/L.1/8MS+6-BA(0.5、1.0、1.5)mg/L+GA0.5 mg/L.1/8MS+6-BA1.0mg/L+GA(0.1、0.3、0.4)mg/L.MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5 mg/L+活性炭0.5 g/L+椰子汁100 mL/L 的培養基進行繼2 代培養，在MS+6-BA1.0 mg/L+GA0.5mg/L+糖（30、45、60）g/L 的培養基上進行繼3代培養。

丹霞梧桐生根誘導：以MS+NAA(0.05、0.1、0.15)mg/L+IBA0、5 mg/L+活性炭0.5 g/L 的培養基及MS+NAA 0.05 mg/L+IBA(0.5、1.0、1.5)mg/L+活性炭0.5 g/L 培養基為基本培養基。在基本培養基的基礎上，添加糖30 g/L，瓊脂粉5 g/L，pH 值調至5.8，培養溫度(26±2)℃，光照強度2000~3000 Lx 作為試驗組，試驗每個處理不少于10 瓶，每瓶2 個外植體，5 次重復。接種后每周對培養物進行觀察記錄，剔除被污染的培養瓶，接種后3 個月統計出苗數量，待5 次重復試驗完成后，總結記錄結果。

2 結果與分析

2.1 不同激素對丹霞梧桐種子預培養的影響

經消毒處理后的種子外植體，在不同的激素濃度培養基中按照大頭朝下、小頭（芽根部）朝上的方式進行接種預培養，在MS+6-BA(0.5、1.0)mg/L+NAA0.5 mg/L+活性炭0.5 g/L+椰子汁100 mL/L 培養基中的外植體生長翠綠而硬挺，莖節粗壯，少部分生長出愈傷組織和不定芽。在其他無活性炭和椰子汁的預培養中出現了玻璃化現象。從表1 可以看出各處理組的發芽率從高到低依次為：MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+活性炭0.5 g/L+椰子汁100 mL/L 處理的發芽率94.87%；MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L 處理的發芽率93.75%；MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭0.5g/L+椰子汁100mL/L處理的發芽率91.67%；MS+6-BA1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L 糖30 g/L+瓊脂5 g/L 處理的發芽率85%。當添加活性炭和椰子汁后，丹霞梧桐種子發芽比較穩定，發芽率較高，長勢相對穩定，其中，MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+ 糖30 g/L+ 瓊脂5 g/L+ 活性炭0.5 g/L+椰子汁100 mL/L 培養基中的發芽率高達94.87%，是丹霞梧桐種子發芽培育的適宜培養基，適用于丹霞梧桐的發芽誘導。

表1 不同激素對丹霞梧桐種子預培養的影響

2.2 不同無機鹽濃度和不同激素濃度對丹霞梧桐生長的影響

丹霞梧桐雖是典型的落葉型植物，但由于繼3 代接種7 d 開始出現了葉片黃化，枯黃并掉落的情況，針對這一情況設計了無機鹽濃度和不同激素濃度探究黃化和落葉的原因。由表2 可以看出，不同的無機鹽濃度和不同的激素濃度均會出現全部黃化落葉的情況，無機鹽的濃度和激素濃度均不造成丹霞梧桐黃化落葉。后期將從其他因素試驗尋找可能造成黃化落葉的原因。

表2 不同無機鹽和不同激素濃度對丹霞梧桐生長的影響

2.3 不同糖濃度對丹霞梧桐增殖生長的影響

繼代增殖的培養基激素相對適宜的是6-BA和GA，根據之前的試驗經驗得出6-BA0.5、1.0 mg/L+GA0.5 mg/L 作為繼代培養效果相對較好，所以在此基礎上進行糖濃度設計不同糖濃度對丹霞梧桐增殖生長的影響。

由表3 可以看出，糖含量在45 g/L 的培養中增殖倍數相對于其他糖濃度高出2~3 倍，后面增殖可以使用糖濃度為45 g/L 的培養基中進行繼代增殖。

表3 不同糖濃度對丹霞梧桐增殖生長的影響

2.4 生根誘導

由表4 數據可以得到IBA 濃度對于丹霞梧桐生根的誘導相對影響較大，當IBA 濃度達到1.5 mg/L時，生根率達75%，植株生長狀況也相對良好。而IAA 的濃度對生根誘導也有一定的作用，但誘導率相對較低。后期的生根誘導中將采用IBA 濃度為1.5 mg/L 進行生根誘導。

表4 不同生根激素濃度對丹霞梧桐生根誘導的影響

2.5 不同pH 值對丹霞梧桐生長的影響

丹霞梧桐是典型的落葉喬木[9]，但在試驗過程中出現了繼3 代開始一周后全部落葉的情況。由表5 可以看出葉片出現一周落葉的現象同生長基質pH 值有較大的關系。對丹霞梧桐生長的丹霞地貌4 個樣方的土壤進行pH 值的測量，分別是4.45、4.12、4.26、4.46，平均值為4.322 5。丹霞梧桐適合生長在酸性土壤，培養基的pH 值也需要相應的降低。

3 結論與討論

丹霞梧桐種子和莖節使用的培養基大致一樣，莖節的培養后期沒有種子培養后期長勢好，在培養基6-BA0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L 中添加椰子汁100 mL/L 對莖節愈傷組織和不定芽的誘導效果比較明顯，在培養基6-BA(0.5、1.0)mg/L+GA0.5 mg/L中添加椰子汁100 mg/L+活性炭0.5 g/L 對種子的愈傷組織和不定芽生長擴繁效果較為顯著。

丹霞梧桐是典型的落葉喬木，生長時期落葉屬于正常的生理性現象，到達培養的中后期，丹霞梧桐的落葉現象會更加明顯。對于無機鹽濃度和激素濃度的調節對于改變丹霞梧桐的生理性落葉沒有直接作用，后期可以再繼續深入嘗試其他試驗方法對丹霞梧桐的生理性落葉進行調節。種子的預培養中MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+ 活性炭0.5 g/L+椰子汁100 mL/L 是最適宜的培養基。針對丹霞梧桐的預培養長出的真葉進行培養，大部分只能培養出愈傷組織和根，誘導不了不定芽，所以預培養產生的真葉都切除以便后期的生長。

本實驗發現用種子和莖節誘導出的愈傷組織容易誘導出不定芽，而葉片誘導的愈傷組織是非胚性愈傷，經過多次試驗摸索，得出最適的分化培養基為6-BA(0.5、1.0)mg/L+GA0.5 mg/L 中添加椰子汁100 mg/L+活性炭0.5g/L，誘導的不定芽可進行增殖繼代培養。通過對丹霞地貌4 個樣方的土壤進行pH 值的測量，平均值為4.32，丹霞梧桐適合生長在酸性土壤，培養基的pH 值也需要相應的降低。下一步計劃開展丹霞梧桐種子播種的土壤中通過pH 值調節來降低葉片黃化掉落的比例試驗，在生根培養基培養至正常生根，當試管苗長至3~4 cm時，在自然光照下煉苗后移栽。