母牛分枝桿菌菌苗對HIV感染合并結核分枝桿菌潛伏感染者外周血T細胞亞群的影響

楊正貴 蔣澤順 劉蘭 韓雪

AIDS是由HIV感染所引起的一種嚴重的免疫缺陷性疾病,是當今全球最嚴重的公共衛生問題。HIV主要攻擊人體CD4+T細胞,引起CD4+T細胞進行性減少,CD8+T細胞相對增加,CD4+/CD8+比值倒置,進而引起一系列疾病[1]。結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)感染是AIDS患者最常見的機會性感染。MTB感染會加重HIV感染者的病程,是AIDS患者死亡的主要原因。為降低HIV感染者活動性結核病的發病率,須盡早在HIV感染者中對結核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI)者進行預防性治療。目前對于HIV感染合并LTBI者主要采用單獨口服異煙肼、利福平或利福布汀等進行抗結核預防性治療[2]。但由于HIV感染者既要接受抗病毒治療又要接受抗結核治療,用藥時間長、用藥種類多、不良反應大,很難全程堅持抗結核治療。

母牛分枝桿菌是1964年Boenicke從母牛乳腺中分離出來的無毒且快速生長的非結核分枝桿菌。因其具有良好的免疫治療和免疫預防作用[3-4],近年來廣泛應用于腫瘤、哮喘、結核病的輔助免疫治療[5-6],也是世界衛生組織在一項Ⅲ期臨床試驗中評估有效性和安全性的唯一菌苗,其在免疫正常人群LTBI者抗結核預防性治療方面的臨床應用價值得到了廣泛認可[7-9]。母牛分枝桿菌菌苗在結核病患者和結核菌素皮膚試驗強陽性學生人群中的使用開展研究較多,但在免疫缺陷人群中研究相對較少。本研究旨在探討HIV合并LTBI者使用母牛分枝桿菌菌苗后是否對其細胞免疫功能有一定的影響,為探索HIV感染者預防結核病的發生提供新的理論依據和技術支撐。

對象和方法

一、研究對象

1.研究對象遴選:采用多中心前瞻性隊列研究方法,對2003年6月至2020年6月寧夏回族自治區銀川市AIDS管理機構管理的HIV感染者進行MTB感染篩查,排除拒絕結核菌素皮膚試驗者和過敏者,共篩查HIV感染者546例。經結核菌素皮膚試驗篩查符合HIV感染合并LTBI標準者133例(24.4%)。按照研究對象納入和排除標準,最終納入96例作為研究對象。按照銀川市所轄6個不同縣區劃分,以興慶區、西夏區篩查出的研究對象作為試驗組,以賀蘭縣、永寧縣、靈武市、金鳳區篩出研究對象作為對照組。試驗組63例,其中,男性55例(87.3%),女性8例(12.7%);年齡范圍為20～60歲,年齡中位數(四分位數)為36.0(31.0,47.0)歲;對照組33例,其中,男性31例(93.9%),女性2例(6.1%);年齡范圍為18～60歲,年齡中位數(四分位數)為36.0(31.0,49.0)歲。兩組患者年齡(Z=-0.460,P=0.645)、性別(χ2=0.435,P=0.510)分布差異均無統計學意義。本研究經寧夏回族自治區第四人民醫院倫理委員會批準(審批號:126400004540028529-01),所有研究對象均簽署知情同意書。

2.納入標準:(1)HIV感染診斷:參照《中國艾滋病診療指南(2018年版)》[1];(2)HIV合并LTBI診斷:根據結核菌素皮膚試驗結果判定;(3)年齡:年齡范圍為18～70歲。

3.排除標準:(1)肝、腎功能不全或有肝、腎疾病者;(2)確診為活動性肺結核者[10];(3)重度免疫缺陷患者(CD4+T細胞計數<200個/μl);(4)妊娠、哺乳期婦女;(5)合并其他嚴重疾病者;(6)有服用異煙肼禁忌證者;(7)吸毒者。

二、研究方法

1.結核菌素皮膚試驗:由培訓合格的專業護士進行操作。于研究對象左前臂內側1/3處注射結核菌素純蛋白衍生物試劑(TB-PPD,北京祥瑞生物制品股份有限公司)0.1 ml,并在72 h后對注射部位進行隨訪觀察。局部紅腫硬結平均直徑<5 mm或無紅腫硬結者判定為MTB感染陰性;局部有紅腫硬結且平均直徑≥5 mm,或有水皰、潰爛者判定為MTB感染陽性。

2.治療方法:(1)試驗組:在高效抗逆轉錄病毒治療的基礎上,注射母牛分枝桿菌菌苗22.5 μg/次(商品名:微卡,安徽龍科馬生物制藥有限公司,生產批號:20191001),每2周注射1次,共3次。(2)對照組:在高效抗逆轉錄病毒治療的基礎上,口服異煙肼300 mg/次(杭州民生藥業股份有限公司,生產批號:T21F060),1次/d,連續服用6個月。

3.實驗室檢測:于治療前和治療結束后1個月、3個月隨訪時,采集研究對象晨起空腹肘部靜脈血5 ml,采用流式細胞儀[艾森生物(杭州)有限公司]對CD4+、CD8+、CD3+等T細胞含量進行檢測,試劑購自安捷倫生物(杭州)有限公司。另外,將研究對象靜脈血離心后利用全自動生化儀進行檢測。

4.臨床觀察指標:(1)免疫指標:CD3+T細胞計數、CD4+T細胞計數、CD8+T細胞計數在治療前和治療結束后1個月、3個月的情況。(2)安全性評價:治療前后進行肝功能及胃腸道功能進行檢查,評估不良反應發生情況。按照實驗室分析結果和臨床指標判定是否異常。

5.質量控制:通過邀請從事AIDS、結核病、檢驗、流行病學研究的專家結合本地區實際情況對治療方案進行評估和篩選,并制定治療方案細則。在項目進行之前,對各個管理機構人員進行任務分配,并且對其負責的部分進行培訓,培訓內容包括注射結核分枝桿菌純蛋白衍生物和母牛分枝桿菌菌苗接種程序,針管的選擇、劑量、注射部位、操作方式等。由于研究對象特殊,要求在問卷調查過程中,調查員要熟悉問卷中的每一個問題,以患者可接受的方式進行調查,保證各項工作高效、高質量地完成,每次工作要進行及時記錄和查漏補缺。為每位研究對象建立檔案記錄本,內容包括知情同意書、問卷調查內容信息、各項指標化驗報告單、藥品發放記錄單及不良反應記錄表等。

三、統計學處理

結 果

一、治療前肝功能情況

治療前,兩組研究對象谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、堿性磷酸酶、谷丙轉氨酶/谷草轉氨酶比值、谷氨酰胺氨基轉移酶、總膽紅素、白蛋白等肝功能指標差異均無統計學意義。具體見表1。

表1 治療前兩組研究對象肝功能指標的比較

二、治療前后T細胞亞群水平變化情況

試驗組CD3+T細胞水平在治療后1個月和3個月均明顯高于治療前,差異有統計學意義;CD4+和CD8+T細胞水平治療后3個月明顯高于治療前,差異有統計學意義。對照組CD3+、CD4+、CD8+T細胞水平在治療后1個月和3個月差異均無統計學意義。治療后3個月,試驗組CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞水平和CD4+/CD8+比值均明顯高于對照組,差異有統計學意義。具體見表2。

表2 兩組研究對象治療前及治療后1個月和3個月T細胞亞群指標變化情況比較

三、治療前后肝功能指標水平變化情況

與治療前相比,對照組在治療后1個月谷草轉氨酶、谷氨酰胺氨基轉移酶水平明顯增高,堿性磷酸酶、白蛋白水平則明顯降低,差異均有統計學意義;治療后3個月堿性磷酸酶水平明顯降低,谷氨酰胺氨基轉移酶水平明顯升高,差異均有統計學意義,谷丙轉氨酶水平略高于正常值范圍(正常參考值:7～40 U/L)。與治療前相比,試驗組在治療后1個月和3個月所有肝功能指標差異均無統計學意義。治療后1個月,試驗組谷草轉氨酶水平低于對照組,差異有統計學意義;治療后3個月試驗組谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶水平均明顯低于對照組,差異均有統計學意義。具體見表3。

表3 兩組研究對象治療前及治療后1個月和3個月肝功能指標變化情況比較

四、不良反應及退出治療情況

在治療過程中,對研究對象進行肝功能檢測和癥狀篩查,建立不良反應和不耐受人員退出機制。對照組由于失訪、肝功能異常(谷丙轉氨酶或谷草轉氨酶高于正常參考值3倍以上)及胃腸道反應原因,導致治療完成率為84.9%(28/33),其中,肝功能異常占整個退出治療原因中的比例為3/5;試驗組無不良反應,無退出治療患者,治療完成率達到100.0%(63/63),明顯高于對照組,差異有統計學意義(χ2=7.235,P=0.007)。

討 論

母牛分枝桿菌菌苗作為一種雙向免疫調節劑,近些年來被發現在預防結核病的發生發展和治療中均有一定的效果,其預防LTBI的主要機制是通過提高感染者的固有和獲得性細胞免疫水平,尤其是升高CD4+T細胞的水平,升高CD4+/CD8+比值,提高針對MTB的特異性細胞免疫功能,阻止LTBI發展成為活動性結核病[11]。因其用藥時間短、不良反應少等優點,接受程度高。HIV感染人體后主要攻擊CD4+T細胞,典型的特征是持續性的CD4+T細胞缺失和功能異常,CD8+T細胞相對增加,導致CD4+/CD8+比例失調。因此,CD4+T細胞水平變化是評估HIV感染者臨床療效和預測疾病發生發展的重要指標,被用于HIV感染者隨訪觀察。如果HIV合并LTBI者能夠通過注射母牛分枝桿菌菌苗提高CD4+T細胞等免疫細胞水平,就可以同時達到提高HIV感染治療療效和預防LTBI發生發展的雙重目標。本研究顯示,HIV感染合并LTBI者注射母牛分枝桿菌菌苗后1個月,CD3+T細胞水平明顯高于治療前,差異有統計學意義,CD4+和CD8+T細胞水平較治療前略有升高,但差異無統計學意義;治療結束3個月時,CD4+、CD8+、CD3+T細胞水平均明顯高于治療前,差異有統計學意義,CD3+、CD4+T細胞水平及CD4+/CD8+比值明顯高于口服異煙肼組,而CD8+T細胞水平明顯低于口服異煙肼組。這與方剛等[8]研究母牛分枝桿菌菌苗輔助抗結核治療方案治療肺結核效果一致。

世界衛生組織推薦HIV合并LTBI者抗結核預防性治療主要選擇6～9個月口服異煙肼方案,而異煙肼的主要不良反應是胃腸道刺激和肝功能損傷。本研究表明,口服異煙肼組中由于失訪、肝功能異常及胃腸道反應等原因,導致最終治療完成率為84.9%;而試驗組在注射母牛分枝桿菌菌苗的整個過程中,無不良反應發生及退出。對兩組研究對象在治療前與治療后1個月和3個月肝功能指標水平變化研究發現,與治療前相比,口服異煙肼組在治療后1個月谷草轉氨酶、谷氨酰胺氨基轉移酶水平明顯升高,堿性磷酸酶、白蛋白水平則明顯降低;治療后3個月堿性磷酸酶水平明顯降低,谷氨酰胺氨基轉移酶水平明顯升高。雖然所有的指標水平均在正常值范圍內變化,但是與治療前相比,口服異煙肼組無論在治療后1個月還是3個月谷氨酰胺氨基轉移酶都保持在比較高的水平,而谷氨酰胺氨基轉移酶作為判斷肝功能情況的轉氨酶,其升高程度越高,說明肝損傷的程度越高[12],提示口服異煙肼可能有增加HIV感染合并LTBI人群肝功能損傷的風險。而且筆者研究還發現,對照組在異煙肼治療完成后3個月,谷丙轉氨酶水平仍略高于正常值范圍。谷丙轉氨酶的升高提示肝細胞受損或壞死,該指標對此有著很強的敏感性和專一性[13],更加表明口服異煙肼會增加HIV感染合并LTBI者肝損傷的可能性。對兩組研究對象在治療結束后同一時間點分析結果發現,在治療結束后1個月,注射母牛分枝桿菌菌苗組谷草轉氨酶水平低于口服異煙肼組;在治療結束后3個月,注射母牛分枝桿菌菌苗組谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶水平均明顯低于口服異煙肼組。高水平的谷丙轉氨酶與谷草轉氨酶都是表明肝臟受損的特異性指標,說明相比于口服異煙肼的治療方法,注射母牛分枝桿菌菌苗可能對HIV感染合并LTBI者的肝功能損傷風險更小。

泰國的一項臨床試驗發現,在應用異煙肼對HIV感染者進行抗結核預防性治療的過程中,共有23.2%的患者發生不良反應[14]。而對于母牛分枝桿菌菌苗用于抗結核預防性治療的安全性在多項研究中都得到了肯定,無論對于一般人群還是合并HIV感染者,都未發現任何不良反應,并且在治療結束后研究對象的肝功能未出現異常[15]。傳統的抗結核預防性治療方案需要口服異煙肼長達至少6個月,治療周期相對較長,難免導致患者依從性下降,出現失訪的情況,因此,治療完成率較低。此外,對于HIV感染合并LTBI者而言,同時服用抗病毒藥物和抗結核藥物加重了肝功能的損傷,且藥物之間的相互作用也更容易導致胃腸道不良反應的發生。而母牛分枝桿菌菌苗不僅不良反應少,也未發現對肝功能有損傷,并且縮短了抗結核療程,使患者的依從性更好,安全性更高。

本研究存在一定的局限性。目前對于LTBI篩查沒有“金標準”,而世界衛生組織推薦的結核菌素皮膚試驗雖然可作為LTBI篩查的手段,但是對于重度免疫缺陷患者,其敏感度較低。另外,本研究屬于多中心研究,由于研究對象的特殊性,很難做到隨機分組,所以按照不同的HIV感染者定點管理治療單位給予不同的干預措施。

綜上,母牛分枝桿菌菌苗在一定程度上能夠改善HIV感染合并LTBI者的細胞免疫功能,而且具有較好的安全性,患者接受度高,為HIV感染者抗結核預防性治療提供了一種新的選擇。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻楊正貴:醞釀和設計實驗、實施研究、采集數據、文章撰寫、對文章的知識性內容作批評性審閱;蔣澤順:醞釀和設計實驗、采集數據、分析/解釋數據;劉蘭:整理數據、分析/解釋數據;韓雪:醞釀和設計實驗、實施研究、對文章的知識性內容作批評性審閱