宮頸鱗癌預后相關lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA網絡構建與分析

劉建兵 李文龍 王偉 李莉 郝敏

(山西醫科大學 1第二醫院婦產科,山西 太原 036000;2基礎醫學院醫學細胞生物與遺傳學教研室)

宮頸癌(CC)是全球影響婦女健康的第4大常見癌癥,更是發展中國家的第2大常見癌癥〔1,2〕。宮頸鱗癌(CSCC)是CC的主要類型。在認識到人乳頭瘤病毒(HPV)感染是誘發CC發生的主要因素后,通過HPV的篩查和疫苗開發,CC的預防已經取得了顯著成就,但是轉移性和復發性CC患者的總體預后仍然很差〔3〕。MicroRNAs (miRNAs)是一段含有20～24個核苷酸的非編碼RNA,能夠通過干擾靶基因mRNA的穩定性及翻譯而影響其表達,對60%以上的人類基因具有調控作用〔4〕。miRNA的異常表達能夠調節細胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡等行為,在癌癥的發生發展中發揮著重要調控作用。miRNA的作用機制是通過與靶基因的3′非翻譯區(UTR)區的靶位點結合,影響靶基因的穩定性和翻譯。競爭性內源RNA(ceRNA),包含了與miRNA靶基因相同的miRNA應答元件(MRE),ceRNA分子能夠與miRNA靶基因競爭性結合同一個miRNA,進而影響 miRNA 對靶基因mRNA表達與翻譯的調控〔5〕。ceRNA能由lncRNA、mRNA、假基因等充當,與miRNA形成ceRNA網路,能夠對細胞的功能和行為等起到調節作用,在CC的發生發展中發揮著重要調控作用〔6〕。

在腫瘤基因圖譜(TCGA)數據庫中,CC的RNA測序、miRNA表達數據及患者的臨床信息已被收錄。已有研究利用ceRNA網絡分析,提示母性表達(MEG)3、具有1型血小板反應蛋白基序9的ADAM金屬肽酶的反應RNA(ADAMTS9-AS)2、乙醇脫氫酶(ADH)7、退樣化家族成員(VGLL)3、細胞色素P450家族26亞家族B成員(CYP26B)1、miR-141、miR-96、miR-3065、miR-330和miR-499a等在CC的發生發展中發揮著重要作用〔7～9〕。本研究擬利用生物信息學方法對癌癥基因組圖譜(TCGA)中收錄的CSCC和癌旁組織的RNA測序數據進行差異表達miRNAs分析,通過生存分析篩選預后相關的miRNAs,并構建預后相關的ceRNA網絡,從而探索CSCC預后相關miRNA的作用機制。

1 材料與方法

1.1樣本信息和RNA序列分析 從TCGA數據庫中下載CC患者的臨床信息和RNA表達數據,并篩選CSCC患者的數據進行分析。排除標準:(1)組織學診斷不是CSCC;(2)沒有完整的數據(包括性別、年齡和生存狀況)。本研究共選擇307個患者的臨床信息納入研究,對CSCC患者的測序數據進行合并,并在R軟件中進行歸一化處理。其中,miRNA、mRNA的表達數據分別包括254和252個腫瘤樣本組織,對照均為3個鄰近的非腫瘤樣本組織。

1.2差異表達分析 R軟件中的“limma”包用于分析差異表達的mRNA、lncRNA和miRNA。差異表達的mRNA和lncRNA篩選標準為|差異倍數(FC)|>2.0 和P<0.01;差異表達miRNA的篩選標準為|FC|>2.5 和P<0.01。P值經過假陽性發生率(FDR)校正。

1.3功能富集分析 使用R軟件中的“ Cluster Profiler”包對差異表達的mRNA進行功能富集分析,篩選出顯著水平(P<0.01)的基因本體論(GO)生物學過程和京都基因和基因組百科全書(KEGG)途徑。

1.4生存分析 差異表達的miRNA與CSCC預后的相關性通過結合臨床數據及使用基于Kaplan-Meier曲線的R軟件中“survival”包來進行分析。

1.5ceRNA網絡的構建 利用R軟件中“GDCRNATools”包〔10〕構建ceRNA網絡。數據庫選擇StarBase,ceRNA網絡構建標準如下:(1)lncRNAs與mRNAs表達呈正相關,判斷標準為相關系數>0.3和P<0.05;(2)lncRNAs和mRNAs具有與同一個miRNA結合的相同結合位點。利用Cytoscape3.6.1對ceRNA網絡進行可視化。

2 結 果

2.1CSCC中差異表達的miRNA鑒定 CSCC中106個差異表達的miRNA,其中70個上調,36個下調。見圖1。表達量上調的前5個miRNA分別為hsa-miR-205-5p、hsa-miR-944、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-141-5p、hsa-miR-203b-3p;表達量下調的前5個miRNA分別為hsa-miR-204-5p、hsa-miR-133a-3p、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-10b-5p。

綠點:上調的miRNA分子;紅點:下調的miRNA分子圖1 CSCC中差異表達miRNAs的火山圖

2.2CSCC中與生存相關的差異表達miRNAs的篩選 通過生存分析發現,9個差異表達miRNA分子與CSCC預后具有相關性,分別是hsa-miR-425-5p、hsa-miR-145-3p、hsa-miR-1307-3p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-210-5p、hsa-miR-142-3p。見圖2。

圖2 CSCC預后相關miRNA分子的篩選與分析

2.3CSCC預后相關的ceRNA網絡構建 為了更好地理解預后相關差異表達的miRNA在CSCC發生發展中的作用機制,根據ceRNA的工作原理,結合miRNA靶位點的預測,成功構建出一個由5個miRNA節點(hsa-miR-425-5p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-142-3p)、132個mRNA節點、44個lncRNA節點和181條邊組成的lncRNA-miRNA-mRNAceRNA網絡。見圖3。

橢圓形代表mRNA,三角形代表miRNA,菱形代表lncRNA圖3 CSCC預后相關miRNA的ceRNA網絡構建

2.4CSCC預后相關ceRNA網絡的GO和 KEGG分析 GO和KEGG分析發現CSCC預后相關ceRNA網絡主要涉及蛋白結合、生長因子結合、轉錄因子的活化、DNA特異序列的結合等分子功能;質膜、細胞核等細胞組分;轉錄的正向調控、心臟發育、信號轉導、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的負調控、心內膜緩沖發育等生物學過程。KEGG信號通路分析顯示,該網絡主要參與環磷酸鳥苷酸-蛋白激酶(cGMP-PKG)信號通路、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號通路、叉頭框蛋白(Fox)O信號通路等的調控。見圖4。

圖4 CSCC預后相關ceRNA網絡的GO和 KEGG分析

3 討 論

預后是惡性腫瘤治療過程中非常重要的評價指標。miRNAs作為一類細胞基因表達、蛋白翻譯等過程中重要調控分子,能夠參與細胞癌變過程的調控,并且影響腫瘤治療后的預后評價。本次研究中篩選獲得了9個與CSCC預后密切相關的miRNAs分子。在以往研究中,這9個miRNAs分子中一些已經被發現與不同器官腫瘤的預后相關,如miR-425-5p與肝細胞癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、CC等預后顯著相關〔11～14〕;miR-142-3p與鼻咽癌、腎癌預后顯著相關〔15,16〕;miR-145-3p和miR-145-5p與前列腺癌預后密切相關〔17〕;miR-142-3p與腎癌預后顯著關聯〔16〕;miR-200c-3p的低表達預示著胰腺導管腺癌的預后較差〔18〕;miR-1307-3p在胃癌中的表達上調能夠作為預測預后評價的指標〔19〕。由此可見,這組miRNAs在不同腫瘤的發生發展中發揮著重要的調控作用,并且能夠影響腫瘤預后,而本研究發現這組miRNA分子與CSCC預后密切相關,提示這些分子其中一個或幾個的組合可能參與CSCC預后調控,可能作為預后評價的指標,為CSCC預后的研究提供了新的靶標,有利于CSCC預后的進一步研究。

ceRNA作為一種新的基因表達調控模式,與miRNA調控網絡相比,ceRNA調控網絡更為精細和復雜,通過構建ceRNA網絡可能找到調控miRNA功能的影響因子。Sun等〔12〕研究表明,miR-425-5p在CC患者的癌組織、外周血中均比對照明顯升高,與腫瘤的分級、分期及淋巴結轉移密切相關,其高表達預示預后較差,這與本研究結果一致。但目前尚未有miR-425-5p參與CC預后調控的機制研究。本研究經過生物信息學的方法探索到miR-425-5p可能通過ceRNA網絡機制實現對預后的調控。其中,AC104083.1、EPB41L4A-AS1、KLF3-AS1等15個lncRNA分子能夠作為ceRNA結合于miR-425-5p,影響其對ArfGAP與FG重復(AGFG)2、色盒(CBX)6、肌動蛋白絲切蛋白(CFL)2等15個靶蛋白分子的轉錄與翻譯,從而實現對疾病預后的調控。

在miR-200c-3p的相關研究中,Liu等〔20〕先前通過生物信息學分析表明其與CC預后顯著相關,與本研究結果相吻合,本研究通過構建ceRNA網絡,發現BAIAP2-AS1、EPB41L4A-AS1、FTX等26個lncRNA分子可能以ceRNA的作用方式結合于miR-200c-3p上,并且影響miR-200c-3p的靶基因ANLN、氯離子通道蛋白(ANO)6、適配器相關蛋白復合物亞基sigma(AP1S)2等105個差異表達基因的表達,從而實現對疾病預后的調控。Li等〔21〕研究顯示,miR-142-3p在CC中低表達,并且與國際婦產科聯盟(FIGO)分級、淋巴結轉移、浸潤深度顯著相關,生存分析表明低表達miR-142-3p的患者具有更差的預后。但是,在本研究中,雖然miR-142-3p在CSCC中顯示高表達,但是低表達miR-142-3p的患者具有更差的預后,這與先前的研究結果一致。本研究進一步發現,MAGI2-AS3、MEG3、MIR100HG等20個lncRNAs可能作為ceRNA調控miR-142-3p對ATPase肌漿/內質網Ca2+轉運(ATP2A)2、BTB域和CNC同系物(BACH)2、堿性核蛋白(BNC)2等37個靶基因的作用,從而影響CSCC患者的預后。MiR-155-5p和miR-145-5p與CSCC預后的相關性尚未見報道,本研究屬于首次表明其與CSCC預后的相關性,可能作為預后指標評價患者預后情況。除了發現miR-155-5p和miR-145-5p與CSCC預后相關外,本研究也找到了39個和23個lncRNAs可能分別作為miR-145-5p和miR-155-5p的ceRNA,分別調控56個和41個靶基因的表達。

綜上,雖然尚缺乏實驗證據,但是利用生物信息學方法篩選獲得了9個可能與CSCC顯著相關的miRNA分子,并且成功構建了預后相關的ceRNA網絡,探索這些預后相關miRNA分子可能的作用機制,這為CSCC預后靶標的探索及影響預后作用機制的研究提供了新靶點和線索。