hsa_circ_0000069通過靶向miR-548c-3p調(diào)控胃癌細胞增殖、細胞周期和凋亡

王貴軍 于天宇 鄧蓓蓓

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1普外科,遼寧 錦州 121000;2采血室)

胃癌是全球第五大惡性腫瘤,其死亡率在所有癌癥排名中居第三位〔1〕。盡管臨床診療策略有所改善,但由于腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險高,預(yù)后較差,胃癌患者總生存期并未得到明顯改善。探索胃癌進展的分子機制,識別有效的分子標(biāo)志物和治療靶點,對提高胃癌患者生存率至關(guān)重要。非編碼RNA(ncRNA)表達異常與胃癌進展關(guān)系密切,環(huán)狀RNA(circRNA)可與靶微小RNA(miRNA)結(jié)合,拮抗miRNA對其下游靶基因的抑制作用,從而調(diào)控胃癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移等惡性表型〔2,3〕。hsa_circ_0000069表達增加與結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征相關(guān),敲低hsa_circ_0000069可抑制結(jié)直腸癌細胞周期進展和體外增殖、遷移能力〔4〕。hsa_circ_0000069高表達預(yù)示宮頸癌患者預(yù)后較差,下調(diào)hsa_circ_0000069表達對宮頸癌進展具有抑制作用〔5〕。靶基因預(yù)測顯示miR-548c-3p是hsa_circ_0000069的潛在靶點。miR-548c-3p已被報道參與多種腫瘤過程,miR-548c-3p通過調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡來改善乳腺癌進展〔6〕。miR-548c-3p還介導(dǎo)下調(diào)hsa_circ_0101145對肝癌細胞的遷移和生長抑制作用〔7〕。然而,hsa_circ_0000069和miR-548c-3p在胃癌中的表達和作用并不清楚。本研究首先分析了胃癌中hsa_circ_0000069和miR-548c-3p表達水平,并從細胞增殖、周期分布、凋亡角度探討hsa_circ_0000069靶向miR-548c-3p在胃癌進展中的作用。

1 材料與方法

1.1胃癌組織 收集2018年3月至2019年10月在錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診并接受手術(shù)治療49例,胃癌患者的癌組織和對應(yīng)癌旁組織,其中男31例,女18例,年齡32～75歲,平均(57±5.65)歲,所有標(biāo)本立即置于液氮中冷凍,后在-80 ℃保存直至RNA提取。所有參與者同意使用其組織樣本。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理審查委員會批準(zhǔn)。

1.2細胞和試劑 人胃癌細胞系SNU-1、AGS、HS-746T和正常胃黏膜細胞GES-1購自中國科學(xué)院上海細胞庫;Trizol試劑、PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連Takara公司;SYBR Green熒光定量染料法試劑盒購自美國ABI公司;si-hsa_circ_0000069、pcDNA-hsa_circ_0000069、miR-548c-3p mimics、anti-miR-548c-3p及各組的陰性對照(si-NC、pcDNA、miR-NC、anti-miR-NC)購自廣州銳博生物公司;細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)購自上海索寶生物科技公司;膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)凋亡檢測試劑盒購自上海愛必信生物公司;兔源剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase)-3單克隆抗體(AC033)、兔源β-actin單克隆抗體(AF5003)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(A0208)購自上海碧云天生物公司。

1.3細胞培養(yǎng) SNU-1、AGS、HS-746T、GES-1細胞均接種添加10%胎牛血清、1%青鏈霉素溶液的RPMI1640培養(yǎng)基中,置于37 ℃、含5%CO2溫箱孵育。細胞80%融合時,胰酶消化后1∶3傳代。

1.4RT-qPCR檢測hsa_circ_0000069、miR-548c-3p表達 采用TRIzol試劑從采集的49對組織樣本和細胞中提取總RNA,測定濃度和純度后,用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA,再用SYBR Green法進行RT-qPCR。引物序列:hsa_circ_0000069上游5′-CTACTTCAGGCACAGGTCTTC-3′,下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;β-actin上游5′-CGTGACATTAAGGAGAAGCTG-3′,下游5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3′;miR-548c-3p上游5′-ACACTCCAGCTGGGCAAAAATCTCAAT-3′,下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′;U6上游5′-CTC GCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCA-CG AATTTGCGT-3′。2-ΔΔCt法計算hsa_circ_0000069、miR-548c-3p表達量。

1.5實驗分組 將對數(shù)期SNU-1細胞接種24孔板,在細胞50%融合時用Lipofectamine2000將siRNA、miRNA mimics、anti-miRNA、pcDNA等轉(zhuǎn)染到細胞中,收集轉(zhuǎn)染48 h細胞,RT-qPCR檢測hsa_circ_0000069或miR-548c-3p水平驗證轉(zhuǎn)染效果。根據(jù)轉(zhuǎn)染寡核苷酸或質(zhì)粒不同,共分為si-NC組、si-hsa_circ_0000069組、miR-NC組、miR-548c-3p組、pcDNA-hsa_circ_0000069組、pcDNA組、si-hsa_circ_0000069+anti-miR-NC組、si-hsa_circ_0000069+anti-miR-548c-3p組。未轉(zhuǎn)染的SNU-1細胞記為對照(NC)組。

1.6CCK-8法檢測細胞活力 將轉(zhuǎn)染48 h SNU-1細胞接種96孔板,貼壁后在每孔中加入10 μl CCK-8試劑,并進一步孵育細胞2 h。用分光光度計在450 nm處測量吸光度(A)以表示細胞活力。

1.7流式細胞儀檢測細胞凋亡和周期分布 用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌轉(zhuǎn)染48 h SNU-1細胞兩次,800 r/min離心5 min,棄上清,加490 μl預(yù)冷結(jié)合緩沖液重懸細胞,加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl 碘化丙啶于細胞懸液中,輕輕混勻。將試管置于冰上,避光孵育10 min,流式細胞儀檢測細胞凋亡。收集轉(zhuǎn)染48 h SNU-1細胞,800 r/min離心5 min,棄上清收集細胞沉淀。用預(yù)冷PBS洗滌兩次,加入預(yù)冷75%乙醇在4 ℃固定5 h。1 500 r/min離心5 min,棄上清,PBS洗滌細胞后,加入400 μl碘化丙啶和100 μl RNase A于4 ℃避光孵育30 min。用細胞周期擬和軟件ModFit分析結(jié)果。

1.8Western印跡檢測Cleaved-caspase-3蛋白表達 用RIPA裂解液提取轉(zhuǎn)染48 h SNU-1細胞總蛋白,用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂乳阻斷后,用Cleaved-caspase-3、β-actin一抗在4 ℃孵育膜過夜。用TBST緩沖液洗滌后,將酶標(biāo)二抗稀釋,室溫孵育膜1 h。化學(xué)發(fā)光檢測試劑顯色,Image Lab軟件對目的蛋白表達進行定量。

1.9雙熒光素酶報告實驗 合成與含有miR-548c-3p預(yù)測靶位點的hsa_circ_0000069野生(WT)序列或具有預(yù)測靶位點的突變(MUT)序列,并將其克隆到pGL3載體中獲得重組載體hsa_circ_0000069-WT、hsa_circ_0000069-MUT。用Lipofectamine2000試劑將miR-548c-3p mimics、miR-NC分別與hsa_circ_0000069-WT或hsa_circ_0000069-MUT共轉(zhuǎn)染。48 h后裂解細胞,測定相對熒光素酶活性。

1.10統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析。每次檢測設(shè)置3個重復(fù),實驗獨立進行3次。采用獨立樣本t檢驗確定兩組數(shù)據(jù)差異,采用單因素方差分析和SNK-q檢驗分析多組數(shù)據(jù)差異。

2 結(jié) 果

2.1胃癌組織中hsa_circ_0000069和miR-548c-3p表達情況 胃癌組織中hsa_circ_0000069表達水平(2.51±0.23)顯著高于癌旁組織(1.00±0.14;t=39.256,P<0.05),miR-548c-3p表達水平(0.43±0.06)顯著低于癌旁組織(1.00±0.16;t=23.350,P<0.05)。

2.2胃癌細胞系中hsa_circ_0000069和miR-548c-3p表達情況 胃癌細胞SNU-1、AGS、HS-746T中hsa_circ_0000069表達水平(2.34±0.20,2.07±0.19,1.93±0.15)顯著高于人正常胃黏膜上皮細胞GES1(1.00±0.11;F=110.190,P<0.05),miR-548c-3p表達水平(0.41±0.04,0.51±0.05,0.50±0.04)顯著低于GES1細胞(1.00±0.09;F=186.174,P<0.05)。選擇表達差異較大的SNU-1細胞進行實驗。

2.3下調(diào)hsa_circ_0000069抑制SNU-1細胞增殖、周期進展,誘導(dǎo)凋亡 與NC組比較,si-hsa_circ_0000069組SNU-1細胞hsa_circ_0000069表達水平、A值、S期細胞比例顯著降低,Cleaved-caspase-3蛋白表達、G0/G1期細胞比例、凋亡率顯著升高(均P<0.001),見圖1、表1。

表1 下調(diào)hsa_circ_0000069表達對SNU-1細胞增殖、周期分布、凋亡的影響

1～3:NC組、si-NC組、si-hsa_circ_0000069組圖1 下調(diào)hsa_circ_0000069表達對SNU-1細胞凋亡、Cleaved-caspase-3蛋白表達的影響

2.4上調(diào)miR-548c-3p表達抑制SNU-1細胞增殖、周期進展,誘導(dǎo)凋亡 與miR-NC組比較,miR-548c-3p組SNU-1細胞miR-548c-3p表達水平、Cleaved-caspase-3蛋白表達、G0/G1期細胞比例、凋亡率顯著升高,A值、S期細胞比例顯著降低(均P<0.001),見圖2、表2。

表2 上調(diào)miR-548c-3p表達對SNU-1細胞增殖、周期分布、凋亡的影響

圖2 上調(diào)miR-548c-3p表達對SNU-1細胞凋亡、Cleaved-caspase-3蛋白表達的影響

2.5hsa_circ_0000069靶向調(diào)控miR-548c-3p表達 Circular RNA Interactome預(yù)測到hsa_circ_0000069序列含有與miR-548c-3p特異性結(jié)合位點,見圖3。同與hsa_circ_0000069-WT共轉(zhuǎn)染時,轉(zhuǎn)染miR-548c-3p可降低細胞相對熒光素酶活性(P<0.05);同與hsa_circ_0000069-MUT共轉(zhuǎn)染時,轉(zhuǎn)染miR-548c-3p對細胞相對熒光素酶活性無顯著影響,見表3。si-hsa_circ_0000069組SNU-1細胞hsa_circ_0000069表達水平顯著低于si-NC組,miR-548c-3p表達水平顯著高于si-NC組(P<0.05);pcDNA-hsa_circ_0000069組SNU-1細胞hsa_circ_0000069表達水平顯著高于pcDNA組,miR-548c-3p表達水平顯著低于pcDNA組(P<0.05),見表4。

表3 相對熒光素酶活性檢測

表4 RT-qPCR檢測miR-548c-3p的表達

圖3 Circular RNA Interactome預(yù)測miR-548c-3p和hsa_circ_0000069的靶向關(guān)系

2.6抑制miR-548c-3p表達可以逆轉(zhuǎn)下調(diào)hsa_circ_0000069對SNU-1增殖、周期分布、凋亡的影響 與si-hsa_circ_0000069+anti-miR-NC組比較,si-hsa_circ_0000069+anti-miR-548c-3p組SNU-1細胞miR-548c-3p表達水平、Cleaved-caspase-3蛋白表達、G0/G1期細胞比例、凋亡率顯著降低,A值、S期細胞比例顯著升高(均P<0.001),見圖4、表5。

表5 抑制miR-548c-3p表達可以逆轉(zhuǎn)下調(diào)hsa_circ_0000069對SNU-1增殖、周期分布、凋亡的影響

1～2:si-hsa_circ_0000069+anti-miR-NC組、si-hsa_circ_0000069+anti-miR-548c-3p組圖4 抑制miR-548c-3p表達可以逆轉(zhuǎn)下調(diào)hsa_circ_0000069對SNU-1細胞凋亡及Cleaved-caspase-3蛋白表達的影響

3 討 論

circRNA是廣泛存在于真核生物細胞的單鏈RNA,其表達豐富、性質(zhì)穩(wěn)定,在癌癥進展的各個生物學(xué)過程中均發(fā)揮重要作用。研究顯示,胃癌中circ_0026344低表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、總生存期等顯著相關(guān)〔8〕。胃癌中circ_0008035表達增加,沉默circ_0008035可抑制胃癌細胞增殖,誘導(dǎo)細胞凋亡和鐵死亡〔9〕。circ_0023642、circ_006100等circRNA高表達可促進胃癌腫瘤形成和轉(zhuǎn)移〔10,11〕。然而,circRNA在胃癌中的功能和調(diào)控機制在很大程度上仍是未知的。本研究結(jié)果提示,hsa_circ_0000069可能參與胃癌進展。研究指出,hsa_circ_0000069高表達與胰腺癌患者較低的總生存率相關(guān),下調(diào)hsa_circ_0000069表達可誘導(dǎo)胰腺癌細胞凋亡和周期阻滯,抑制其增殖和轉(zhuǎn)移〔12〕。在宮頸癌中hsa_circ_0000069通過與miR-4426特異性結(jié)合促進腫瘤細胞增殖和遷移〔13〕。本研究結(jié)果提示,hsa_circ_0000069在胃癌中起著致癌因子作用,下調(diào)hsa_circ_0000069通過抑制細胞增殖、周期進展、誘導(dǎo)細胞凋亡來抑制胃癌進展。

miR-548c-3p表達水平是評價骨肉瘤良惡性水平的重要參考指標(biāo),上調(diào)miR-548c-3p表達可促進骨肉瘤細胞凋亡〔14,15〕。miR-548c-3p通過抑制缺氧誘導(dǎo)的因子(HIF)1α介導(dǎo)的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號通路調(diào)控乳頭狀甲狀腺細胞活力和遷移能力,抑制腫瘤進展〔16〕。miR-548c-3p還可抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖和遷移〔17〕。本研究與前人〔17〕報道的抗腫瘤作用吻合。既往研究顯示,circRNA、lncRNA等ncRNA可與miRNA結(jié)合并抑制miRNA功能,如circ_0001017可抑制致癌因子miR-197表達來抑制胃癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移〔18〕;LINC00266-1通過靶向下調(diào)miR-548c-3p誘導(dǎo)骨肉瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移〔19〕。本研究結(jié)果表明,hsa_circ_0000069通過靶向負調(diào)控miR-548c-3p進而參與胃癌進展。然而,本研究僅進行了體外細胞實驗,仍需開展動物實驗進一步驗證hsa_circ_0000069靶向miR-548c-3p在胃癌中的作用。