從CaM-MLCK信號通路探究不同頻率摩腹對脾虛家兔的手法效應

蔡偉藍，王繼紅，許嘉英，張強，任雪晗，黃志凱

（廣州中醫藥大學，廣東廣州 510405）

摩法為推拿基礎手法之一，《禮記·內則》曰：“濯手以摩之，去其皽?！薄端貑枴げ∧堋吩唬骸澳χ兄?。”摩腹作為摩法治療脾胃病變的重要手法之一，通過摩法和腹部穴位結合，可調理脾胃功能，達到健脾的作用[1]。正如《理瀹·駢文》所言：“后天之本在脾，調中者摩腹?！逼⑻撟C是中醫學常見的證型，主要表現為胃納差、脘腹脹滿、大便稀溏等消化系統功能低下狀態，與胃腸動力障礙有密切聯系[2-3]?，F代醫學研究[4]表明，胃腸動力障礙與胃腸平滑肌收縮、舒張有關，而鈣調蛋白（CaM）-肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）信號通路是典型的胃腸道平滑肌信號通路。本課題組前期研究[5]表明，摩腹可以治療脾虛家兔，改善脾虛癥狀。為進一步分析摩腹的手法效應，探討摩腹改善脾虛家兔胃腸動力機制，本研究從CaM-MLCK 信號通路切入，觀察不同頻率摩腹干預對通路中關鍵蛋白CaM、MLCK 的影響，以期為摩腹臨床治療脾虛證提供參考，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級成年新西蘭SD家兔72只，體質量（2.0±0.5）kg，雌雄各半，購自山東省康大生物科技有限公司，實驗動物生產許可證編號：SCXK（魯）20160002。飼養于廣州中醫藥大學科技園普通級家兔實驗室，在溫度24 ℃、相對濕度50%～70%的環境中進行為期1周的適應性喂養，期間家兔正常攝食、飲水、自由活動。本動物實驗方案已通過廣州中醫藥大學科技產業園動物倫理委員會審批通過（批號：PZ21027）。適應性喂養結束后，隨機分為空白組、模型組、低頻摩腹組、高頻摩腹組、低頻摩腹+抑制劑組、高頻摩腹+抑制劑組，每組12只，雌雄各半。

1.2 儀器與試劑調制器、校對器、動態數據采集器、Tekscan 研制的多點薄膜壓力測試系統（MFF）壓力傳感器（上海邑成測試設備有限公司）；人工智能機械臂（疆越科技研制730C 型）；SMA4000 超微量分光光度計（北京Merinton 公司）；ABI7500 熒光定量PCR 儀（美國Life Technology 公司）。ML-9 試劑（為MLCK 選擇性強效抑制劑，北京生物技術有限公司生產，批號：YZM002844）；GAPDH 抗體（兔源）、CaM 抗體（兔源）、MLCK 抗體（兔源）（華安生物公司）；山羊抗兔IgG（H+L）抗體（DL800）（美國Proteintech 公司）；BestarTMqPCR RT KitBestar?、SYBR Green qPCR mastermix（德國DBI公司）。

1.3 手法頻率與壓力值校對本次實驗選取10名測試者，行10 次測試，再將測試者的壓力平均值作為機械臂操作的壓力標準操作值。將數據采集器、調制器、傳感器、智能機械臂有序連接，將機械臂置于家兔腹部操作手法，并控制頻率在101～ 150 次/min、201～ 250 次/min 兩個頻率，維持同等力量值操作1 min，觀察壓力曲線變化，建立力-電壓之間的擬合函數模型y=a+bx，然后通過校對器得出曲線的標準力量值和頻率值。技術人員提前在電腦Dobot Studio 系統上設置，操作智能機械臂在多點薄膜壓力測試系統（MFF）下進行手法操作，手法壓力值以觀察實時采集數據為度量標準，其均值應控制在以上標準操作值上下不超過5%[5]。

1.4 造?？瞻捉M家兔繼續給予常規飼養，其余組采用苦寒瀉下法聯合饑飽失常法構建脾虛模型[6-7]。方法：將190 g 大黃放入900 mL 水中浸泡20 min，大火煎至沸騰后改小火再煎10 min，加水增至1 140 mL，紗布過濾；再將190 g番瀉葉加入1 140 mL沸水中攪拌浸泡5 min，過濾；將大黃液和番瀉葉液各1 140 mL 混合，溶化152 g 芒硝，最終濃度為6 mL 藥液含大黃2 g、番瀉葉1 g、芒硝0.4 g（大黃∶番瀉葉∶芒硝=5∶2.5∶1）[5]。除空白組外，其他各組家兔按照24 mL/kg 劑量連續灌胃1周，每日1次。期間飼料量減半，飲水不限制，全程詳細記錄各家兔體質量、進食量、行為學表現及大便變化情況。家兔出現便溏后改灌胃量為18 mL/kg。造模后出現精神萎靡，反應明顯遲鈍，甚至出現膽怯易驚，體質量減輕，食量變小，毛發色澤黯淡、無光澤，大便干硬或稀溏、難以成形等脾虛癥狀，則表明造模成功[2]。

1.5 干預方法

1.5.1 穴位定位 本實驗選取中脘穴、雙側天樞穴。按《實驗針灸學》[8]定位：中脘穴，位于家兔腹中線上，臍與劍狀軟骨連線中點處；天樞穴，位于家兔臍旁開3 cm處。

1.5.2 手法操作 將家兔固定在操作臺上，呈仰臥位，2 名助手固定住家兔前后肢，剃除腹部毛發以充分暴露穴位，并用標記筆標識，將傳感器固定在穴位上。在電腦上運行Dobot Studio 軟件，輸入測試時求出的機械臂力值參數，操作機械臂遠端人體拇指模型于家兔腹部的中脘穴、天樞穴（雙）上行摩腹，全程保證拇指模型與家兔腹部皮膚表面垂直，同時為保證手法力度與波形穩定，需時刻留意手法的壓力曲線變化。

1.5.3 分組干預 造模結束后，空白組、模型組不進行任何手法干預；低頻摩腹組、低頻摩腹+抑制劑組利用人工智能機械臂進行低頻率（101～150 次/分）摩腹干預；高頻摩腹組、高頻摩腹+抑制劑組利用人工智能機械臂進行高頻率（201～250 次/分）摩腹干預；低頻摩腹+抑制劑組、高頻摩腹+抑制劑組每次手法干預前行腹腔注射ML-9（2 mg/kg）[9]。每穴操作5 min，3 穴共15 min，每日1次，連續10 d。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 脾虛觀察指標 記錄所有家兔每日的精神狀態、毛色、體質量、進食量、二便等情況。

1.6.2 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察胃黏膜病理變化 取胃小彎組織，固定，石蠟包埋。將石蠟切片脫蠟至水后，入蘇木素染3～ 8 min，自來水洗；1%鹽酸酒精分化數秒，自來水沖洗；0.6%氨水返藍，流水沖洗；入伊紅染液中染色1～3 min。脫水封片。光鏡下觀察胃黏膜病理變化。

1.6.3 qPCR 法檢測胃小彎組織CaM、MLCK 的mRNA 表達 提取胃小彎組織總RNA，運用紫外分光光度法檢測其純度和濃度，將總RNA 逆轉錄為cDNA。進行PCR 反應，反應程序：95 ℃2 min預變性；95 ℃10 s 變性，60 ℃15 s 退火，72 ℃30 s 延伸，45 個循環；總延伸為95 ℃10 s，60 ℃3 s，98 ℃10 s。重復操作3次，通過PCR 儀運行ASA-9600 系統軟件得出數據，采用2-ΔΔCT法計算目標蛋白的相對表達水平。GAPDH（為內參）、CaM 和MLCK 引物由Life Technology 公司合成，引物見表1。引物的擴增長度均為20 bp。

表1 PCR引物序列信息Table 1 PCR primer sequences information

1.6.4 Western Blot 法檢測胃小彎組織CaM、MLCK 的蛋白表達 取胃小彎組織，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑后勻漿、離心，取上清液（即為所要提取的總蛋白）。利用二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白總濃度并調整濃度后上樣、煮沸變性、制膠、電泳、轉膜、5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入CaM、MLCK、GAPDH 一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜、山羊抗兔IgG（H+L）二抗（1∶4 000）室溫孵育1 h，顯色，顯影成像，拍照。運用ImageJ 軟件測定條帶灰度值，計算目的蛋白灰度值與內參蛋白GAPDH灰度值的相對表達量。實驗重復3次。

1.7 統計方法運用SPSS 26.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組家兔脾虛指標比較造模前，各組家兔精神狀態佳，動作靈活，毛發順滑有光澤，飲食正常，大便正常，糞便成形。造模后，家兔表現為精神狀態差，精神萎靡，反應明顯遲鈍，甚至膽怯易驚，毛發黯淡無光澤，體質量減輕，進食減少，大便干硬或稀溏，表明造模成功；給予摩腹干預后，低頻摩腹組、低頻摩腹+抑制劑組、高頻摩腹+抑制劑組家兔反應較治療前敏捷，毛發逐漸恢復光澤，體質量、飲食較治療前改善，大便性狀逐漸恢復正常，而高頻摩腹組各項指標較治療前均變差，脾虛癥狀加重。

進一步比較各組家兔造模前后體質量、進食量2 個指標。表2、表3 結果顯示：與空白組比較，模型組、低頻摩腹組、高頻摩腹組、低頻摩腹+抑制劑組、高頻摩腹+抑制劑組家兔體質量、進食量均減少，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，低頻摩腹組、高頻摩腹組、低頻摩腹+抑制劑組、高頻摩腹+抑制劑組的體質量、進食量均無統計學差異（P＞0.05）。結果進一步證明造模成功。

表2 各組家兔造模前后體質量比較Table 2 Comparison of body mass among each group of rabbits before and after modeling（）

表2 各組家兔造模前后體質量比較Table 2 Comparison of body mass among each group of rabbits before and after modeling（）

注：①P＜0.05，與空白組比較

表3 各組家兔造模前后進食量比較Table 3 Comparison of the amount of food intake among each group of rabbits before and after modeling （）

表3 各組家兔造模前后進食量比較Table 3 Comparison of the amount of food intake among each group of rabbits before and after modeling （）

注：①P＜0.05，與空白組比較

2.2 各組家兔干預后胃黏膜病理變化比較空白組：胃黏膜上皮細胞排列規則，隱窩及腺體結構清晰；模型組：胃黏膜上皮細胞排列規則，部分見淋巴細胞浸潤；低頻摩腹組：胃黏膜上皮細胞排列規則，黏膜稍微疏松水腫；低頻摩腹+抑制劑組：胃黏膜上皮細胞排列規則，黏膜結構明顯疏松水腫；高頻摩腹+抑制劑組：胃黏膜上皮細胞排列規則，部分可見柱狀上皮破壞；高頻摩腹組：胃黏膜上皮細胞大部分柱狀上皮破壞，部分淋巴細胞浸潤。與模型組比較，低頻摩腹組、低頻摩腹+抑制劑組、高頻摩腹+抑制劑組家兔胃小彎組織結構和形態均有恢復，而高頻摩腹組家兔胃小彎組織結構和形態損傷均有所加重。見圖1。

圖1 各組家兔干預后胃黏膜病理變化比較（HE染色法，×400）Figure 1 Comparison of histopathological changes in the gastric mucosa among each group of rabbits after intervention（HE staining，×400）

2.3 各組家兔胃小彎組織CaM、MLCK mRNA表達水平比較表4結果顯示：與空白組比較，模型組家兔胃小彎組織CaM、MLCK mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，低頻摩腹組家兔胃小彎組織CaM、MLCK mRNA 表達水平上調（P＜0.05），高頻摩腹組CaM、MLCK mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05），低頻摩腹+抑制劑組、高頻摩腹+抑制劑組CaM、MLCK mRNA 表達水平亦顯著降低（P＜0.05）；與低頻摩腹組比較，高頻摩腹組家兔MLCK 的mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05）。

表4 各組家兔胃小彎組織CaM、MLCK mRNA表達水平比較Table 4 Comparison of mRNA expression levels of CaM and MLCK in the tissue of the stomach lesser curvature among each group of rabbits（）

表4 各組家兔胃小彎組織CaM、MLCK mRNA表達水平比較Table 4 Comparison of mRNA expression levels of CaM and MLCK in the tissue of the stomach lesser curvature among each group of rabbits（）

注：①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與低頻摩腹組比較

2.4 各組家兔胃小彎組織CaM、MLCK 蛋白表達水平比較圖2、圖3 結果顯示：與空白組比較，模型組家兔胃小彎組織CaM、MLCK 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，低頻摩腹組家兔CaM、MLCK 蛋白表達水平升高（P＜0.05），高頻摩腹組CaM、MLCK 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），低頻摩腹+抑制劑組、高頻摩腹+抑制劑組CaM、MLCK 蛋白表達水平亦顯著降低（P＜0.05）；與低頻摩腹組比較，高頻摩腹組家兔MLCK蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。

圖2 各組家兔CaM、MLCK、GADPH的蛋白電泳圖Figure 2 Protein electrophoresis of CaM，MLCK and GADPH

圖3 各組家兔胃小彎組織CaM、MLCK蛋白表達水平比較Figure 3 Comparison of protein expression levels of CaM and MLCK in the tissue of the stomach lesser curvature among each group of rabbits

3 討論

中醫認為，“脾”主運化，若飲食失節、脾失健運，則導致中焦氣機升降失常，脾氣上升受阻，胃氣下降異常而發病。脾虛是胃腸道疾病發病的基本病機。平滑肌的收縮與舒張是維持消化功能穩定的基礎[10]。解剖學表明，從食管至肛門這一系列器官和組織組成的消化系統，均由平滑肌構成。而CaM-MLCK 通路與胃腸道中維持消化功能的平滑肌收縮與舒張有關[11]，是調節平滑肌收縮的經典信號通路[4]。在調節平滑肌收縮時，CaMMLCK 通路作為粗肌絲核心調節通路，在胃腸道上的平滑肌細胞接收刺激以及信號傳導過程中起關鍵作用[12]。當外部電信號刺激，內質網和胞外的Ca2+濃度發生變化，胞內Ca2+濃度升高促使Ca2+向胞漿內釋放，進而與胞內鈣調蛋白結合后形成Ca2+-CaM 復合物，此時廣泛分布于平滑肌等肌肉組織中的MLCK 被Ca2+-CaM 復合物激活，發生絲氨酸殘基磷酸化后激活平滑肌肌球蛋白ATP 水解酶水解ATP，將化學能轉換成機械能，釋放能量后使肌球蛋白能夠沿著肌動蛋白絲滑動，引起平滑肌收縮[13]。故本實驗基于CaM-MLCK 通路探討摩腹手法效應。

“補瀉”的合理運用是中醫治療的基本原則之一，推拿手法治療疾病時須遵循這一原則，摩腹也不例外?！独逭茨σg》記載：“緩摩為補，急摩為瀉?！睆娬{了手法治病注重“補瀉”原則，而手法的緩急補瀉原則往往體現在手法頻率的高低[14]。本課題組前期研究[15]指出，推拿手法治療疾病存在一定的頻率-效應關系，其中關于摩法治療胃腸疾病時，101～ 150 次/分為最佳的治療頻率段，起到補的良性效應，而頻率201～250 次/分則起到瀉的損益效應。

本研究結果顯示：與模型組比較，低頻摩腹組家兔胃黏膜上皮細胞排列規則，稍有水腫，胃小彎組織CaM、MLCK 的mRNA 及蛋白表達水平顯著升高，高頻摩腹組家兔胃黏膜上皮細胞大部分柱狀上皮破壞，部分淋巴細胞浸潤，CaM、MLCK的mRNA 表達水平顯著降低，蛋白表達水平顯著降低。同時，與低頻摩腹組比較，高頻摩腹組家兔胃黏膜上皮細胞被破壞，部分淋巴細胞浸潤，MLCK 的mRNA 和蛋白表達水平顯著降低。經摩腹干預治療后，低頻摩腹組家兔反應較治療前靈敏，毛發逐漸恢復光澤，體質量、飲食較治療前好轉，大便成形，高頻摩腹組各項指標較治療前均變差。表明低頻率（101～150 次/分）摩腹能促進脾虛家兔消化功能恢復，具有補的良性效應；而高頻率（201～250 次/分）無法促進胃腸消化功能恢復，甚至有一定的破壞性，具有瀉的損益效應。本實驗進一步證實了“緩摩為補，急摩為瀉”的原理[16-18]，同時也體現了手法在治療過程中注重補瀉原則的意義。本研究采用高頻率的摩腹對脾虛家兔進行干預，結果顯示，造模成功后的家兔處于脾虛狀態，給予高頻率摩腹干預后家兔胃腸消化功能未得到恢復，高頻率摩腹起到了瀉法的作用，甚至有一定的破壞性，驗證了“補瀉反則病益篤”的中醫治療原則。

另外，本研究結果還顯示，與模型組比較，低頻摩腹+抑制劑組、高頻摩腹+抑制劑組家兔胃小彎組織CaM、MLCK 的mRNA 和蛋白表達水平顯著降低。理論上分析認為，這2組家兔的胃腸道消化功能會比治療前變差，甚至加重，但實際上低頻摩腹+抑制劑組、高頻摩腹+抑制劑組家兔反應較前靈敏，毛發逐漸恢復光澤，體質量、飲食較前好轉，大便成形。ML-9 為MLCK 的特異性抑制劑，阻斷CaM-MLCK 信號通路的表達后，摩腹仍能改善脾虛家兔的胃腸道功能，這提示摩腹除了通過CaM-MLCK 信號通路可能作用在其他信號通路或靶點上促使胃腸平滑肌收縮。目前已知調節胃腸運動的途徑，還包括了KC、PAR-2[19]介導及c-kit/SCF 的信號通路，后續有待從以上信號通路研究摩腹在MLCK信號通路被抑制情況下仍能發揮調理胃腸、改善消化功能作用的機制，進一步深究摩腹的作用機制。

綜上所述，摩腹治療脾虛家兔可通過促進CaM-MLCK 信號通路上CaM、MLCK 的mRNA 和蛋白表達，引起胃腸平滑肌收縮，促進胃腸動力，進而改善脾虛狀態。其中：低頻率（101～150次/min）摩腹具有補的效應，可能與上調CaM、MLCK 的mRNA 和蛋白表達水平從而激活CaM-MLCK 信號通路有關；而高頻率（201～ 250 次/ min）摩腹起到瀉的效用，與下調CaM、MLCK 的mRNA 和蛋白表達水平從而抑制CaM-MLCK信號通路有關。