柚皮素緩解干眼病引起的角膜疼痛綜合征的機制研究

印健，顧宇亮

（江蘇省昆山市中醫醫院眼科，江蘇昆山 215300）

干眼病（dry eye disease，DED）是眼科常見的眼表和淚液疾病，伴有神經感覺異常[1-2]，以眼部干澀、異物感、燒灼感、瘙癢和疼痛等癥狀為主要臨床表現[3]。角膜為透明的無血管組織，是機體神經分布最密集的組織[4]。角膜傷害性神經支配為睫狀神經，其中，神經元位于三叉神經節（TG）的眼支中[5-6]。三叉神經節是口腔頜面部從外周到中樞神經系統疼痛傳遞和疼痛調節的關鍵部位[7]。不同類型的受體（機械傷害感受器、多模態傷害感受器和溫度感受器）共存于單個角膜神經末梢上[8]，大約40%是多模態傷害性感受器，對熱、酸和化學試劑敏感，50%是冷的溫度感受器，10%是機械傷害感受器[9]。有害的（包括熱、機械、化學）刺激和炎癥可以誘導干眼病角膜感覺神經元終端激活，導致痛覺增強[8]。

目前，人工滴眼液和環孢霉素是干眼病的主要治療方法[10-11]。雖然這些干預措施已被廣泛應用于緩解眼部癥狀，但通常只對輕度干眼病癥狀提供短期緩解，對中度至重度干眼病癥狀無效。因此，有必要探尋更優的干預措施和藥物。近年來，一些植物化學物質因具有較強的抗氧化、抗炎功能有助于減輕干眼病癥狀，且副作用和毒性小，因此受到特別的關注。化橘紅為蕓香科植物化州柚Citrus grandis“Tomentosa”或柚Citrus grandis（L.）Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外層果皮，有散寒、燥濕、消痰、利氣等功效，用于風寒咳嗽、喉癢痰多、食積傷酒、嘔惡痞悶等癥。柚皮素（naringenin，NAR）是來源于化橘紅的一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、鎮咳以及抗癌等多種藥理活性，其目前已成為眼病治療的熱點之一[12-13]。

趨化因子13（CXCL13），也被稱為B 淋巴細胞螯合劑，最初在B 細胞濾泡的基質細胞中被發現，可調節B 細胞和T 細胞亞群的歸屬[14]。既往研究表明，CXCL13 在正常中樞神經系統中不表達，但在某些病理條件下在大腦和脊髓中呈高表達[15-16]。另外，Colafrancesco 等[17]發現，CXCL13能夠作為干燥綜合征（Sj?gren’s syndrome）組織學病變的生物標志物。因此，本研究以CXCL13為切入點，旨在探討柚皮素對干眼病引起的角膜疼痛綜合征的緩解作用機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

24 只清潔級8 周齡成年雄性C57BL/6 小鼠，體質量（23.48±0.04）g，購自無錫恒泰實驗動物養殖有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2023-0005，實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2023-0006。小鼠被隨機分配到籠子里（6 只/籠），并在受控條件下維持溫度（22 ± 1）℃，相對濕度（60 ± 10）%，12 h/12 h 光/暗周期，自由進食和飲水。所有的動物實驗程序都嚴格按照江蘇省昆山市中醫醫院批準的實驗動物護理和使用機構指南進行，動物倫理審批號（院科倫審：AEWC-2010293）。

1.2 藥物、試劑與儀器

柚皮素（NAR，分子式：C15H12O5，分子量：272.25，分子式見圖1）購自北京索萊寶科技有限公司，CAS 號：480-41-1，純度≥98%。淚腺凝膠（英國Dechra 公司）；MinuteTM總蛋白提取試劑盒（美國Invent Biotechnologies 公司）；SYBR Green PCR Master Mix（日本TaKaRa公司）；CXCL13 抗體、GAPDH 抗體、IgG 二抗（美國Abcam 公司）；c-FOS抗體（美國Santa Cruz公司）。Alcon Ⅱ電子顯微鏡（德國Leica公司）；BX51顯微鏡（日本Olympus公司）；NanoZoomer2.0-HT 數字切片掃描設備（日本Hamamatsu Photonics 公司）；Rotor-Gene 6000 熒光定量PCR儀（德國Hamburg 公司）；ScanLater Western Blot檢測系統（美國Bio-Rad 公司）。

圖1 柚皮素分子結構Figure 1 Molecular structure of naringenin

1.3 分組與造模

將24 只小鼠隨機分為4 組：sham 組（假手術對照組）、DED 組（干眼病模型組）、DED+DMSO 組（治療對照組）、DED+NAR 組（柚皮素治療組）。每組6 只。

DED 組小鼠處理方法如下：腹腔注射氯胺酮（80 mg/kg）和賽拉嗪（8 mg/kg）麻醉小鼠，進行單側（右側）眶外淚腺（ELG）和哈德氏腺（HG）切除。手術前，在兩只眼睛上均滴一滴淚腺凝膠。在手術顯微鏡下，在顳側做一個8 mm 的皮膚切口，暴露并切除眶外淚腺。在分離眼眶上方靠近內眥的結膜組織后，小心地取出哈德氏腺。通過檢查手術區是否有任何殘留的腺體組織來驗證是否完全切除。然后使用6.0 編織絲線縫合皮膚切口。在切口處滴上一滴碘酒溶液，以避免細菌感染。根據眼瞼閉合時間及角膜機械閾值判斷造模是否成功。對于sham 組小鼠：在同一區域做一個切口，但不接觸腺體。小鼠被放置在溫暖（30 ℃）的籠子里，以便從手術中恢復。

DED+DMSO 組及DED+NAR 組小鼠處理步驟如下：在手術前，使用柚皮素進行眼局部治療。從手術后第7 天開始，只在右眼進行DMSO 溶劑（DED+DMSO 組）或1%柚皮素（DED+NAR組，柚皮素溶于DMSO，滴入劑量為50 μL）眼部局部滴注，持續到第21 天。DED 小鼠每天在籠子里接受2 次治療（上午10 點和下午5 點）。此外隨機排列籠子順序，以進行眼部局部滴注。所有測試都在第21 天進行。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 行為測試

首先進行行為測試。對于行為測試，實驗開始前30～60 min，將小鼠放置在測試室。

1.4.1.1 角膜對化學和機械刺激敏感性的測量

將1%柚皮素應用于右眼后，立即將動物放入單獨的籠子中，通過測量5 min 內右眼眼瞼的閉合時間長度檢測角膜的化學敏感性。使用Von Frey纖維絲測痛儀檢測機械角膜敏感度[18]。將經過校準的Von Frey 細絲（0.008～0.04 g）的力施加到被固定小鼠的角膜中心。機械閾值與眨眼反應相對應。

1.4.1.2 高架十字迷宮試驗

將動物置于高架十字迷宮的中心區域，使其頭部朝向閉合臂，開啟攝像監控器記錄5 min 內小鼠在開放臂中花費的時間。使用Smart 3.0 軟件（Harvard Apparatus）分析行為參數。

1.4.1.3 黑白箱試驗測試焦慮

測試裝置由一個盒子組成，盒子分為一個小（三分之一）暗室和一個大（三分之二）明亮的照明室。將小鼠放入照明的隔間中，并允許在兩個室之間自由移動。進入暗室的第1個潛伏期和在亮室中花費的總時間是小鼠明亮空間焦慮的指標。測試前，小鼠適應實驗室至少60 min。使用視頻跟蹤系統，并用Smart 3.0 軟件（Harvard Apparatus）分析行為參數。在動物實驗之間，用70%乙醇清潔試驗箱的地板和墻壁，以避免任何干擾。

1.4.2 c-FOS檢測

小鼠被安樂死后，解剖取腦，采集杏仁核，固定，脫水、石蠟包埋和制片。脫蠟和水化，抗原修復，消除內源性過氧化物酶活性，用5%正常山羊血清孵育30 min。然后加入c-FOS 抗體（1∶200）4～ 8 ℃孵育48 h，PBS 洗滌后，加入生物素化山羊抗兔二抗（1∶200）中孵育2 h，再次PBS 洗滌，放入親和素-生物素-過氧化物酶復合物溶液中60 min。最后，二氨基聯苯胺（DAB）用于可視化c-FOS 免疫反應性，PBS 洗滌終止顯色，脫水，封片。使用Olympus BX51 顯微鏡對切片進行掃描，借助圖像分析系統，對c-FOS陽性細胞進行計數。

1.4.3 睫狀神經纖維自發和受激活動的多單位細胞外記錄

自發性睫狀神經纖維活性在第21 天測定。小鼠被安樂死后，迅速摘下右眼（手術側）。在（33 ±1）℃和pH 7.4 的條件下，用超灌注生理鹽水對角膜進行基線記錄。本研究對睫狀神經的誘發活動是在熱刺激下測量的，在pH 7.4 下將超融合鹽水的溫度從（33±1）℃降至（20±1）℃（冷刺激）或高達（40±1）℃（熱刺激）。使用吸引電極（Ag/AgCl）記錄睫狀神經的多單位細胞外電活動。信號被濾波（300～5 000 Hz）放大（×10 000），并通過Spike 2數據分析軟件（CED Micro1401，Cambridge Electronic Design）以10 000 Hz 的采樣頻率數字化。在進行電生理記錄之前，將角膜與超融合生理鹽水溶液超融合30 min 以穩定準備。自發性細胞外睫狀神經纖維活動定義為每秒脈沖（imp/s）。

1.4.4 RT-qPCR分析

使用TRIzol 試劑提取三叉神經節（TG）的總RNA。逆轉錄后，應用SYBR Green PCR Master Mix 在熒光定量PCR 儀中進行qPCR 分析。引物由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，引物序列如下：CXCL13 Forward：5’-GGCCACGGTATTCTGG AAGC-3’，Reverse：5’-ACCGACAACAGTTGAA ATCACTC-3’。IL-1β Forward：5’-ACTCATTGT GGCTGTGGAGA-3’，Reverse：5’-TTGTTCATCTC GGAGCCTGT-3’。IL-6 Forward：5’-CTGCAAGAG ACTTCCATCCAG-3’，Reverse：5’-AGTGGTATAG ACAGGTCTGTTGG-3’。IL-10 Forward：5’-GCTCT TACTGACTGGCATGAG-3’，Reverse：5’-CGCAGC TCTAGGAGCATGTG-3’。GAPDH Forward：5’-GC TTGAAGGTGTTGCCCTCAG-3’，Reverse：5’-AG AAGCCAGCGTTCACCAGAC-3’。擴增長度均為200 bp。PCR反應條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃45 s，40個循環。GAPDH作為內參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。

1.4.5 Western Blot 法檢測三叉神經節CXCL13表達水平

使用MinuteTM總蛋白提取試劑盒提取三叉神經節總蛋白。用二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度。然后，將等量的蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）。將凝膠中分離的蛋白質轉移到聚偏氟乙烯膜（PVDF）上。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，將膜與一抗CXCL13（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）孵育過夜。洗膜后在室溫下與IgG 二抗（1∶5 000）孵育1 h。洗膜后，用增強化學發光試劑（ECL）試劑盒顯色，以Western Blot 檢測系統檢測，用ImageJ 軟件對灰度圖進行半定量分析。GAPDH 為內參。

1.5 統計方法

采用SPSS 21.0 統計軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差（）表示。2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），事后檢驗采用Tukey’s 多重比較法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 干眼病誘導小鼠化學和機械性角膜過敏和焦慮樣行為

模型組小鼠的眼瞼閉合時間較sham 組顯著增加（P＜0.01），見圖2-A。與sham 組比較，模型組小鼠的角膜機械閾值顯著降低（P＜0.01），見圖2-B。本研究使用2 種行為測試來檢驗小鼠焦慮狀態，高架十字迷宮結果顯示：模型組小鼠開臂停留時間較sham 組顯著降低（P＜0.01），見圖2-C；黑白測試結果顯示，模型組小鼠在白色區域花費的時間同樣顯著低于sham組（P＜0.01），見圖2-D。杏仁核在慢性焦慮和疼痛的發展中起著重要作用。本研究觀察了干眼病小鼠大腦杏仁核中c-FOS免疫反應性（神經元激活的標志）的變化，結果顯示，模型組小鼠杏仁核中cFOS 陽性細胞數量高于sham組（P＜0.05），見圖2-E。

圖2 干眼病誘導小鼠化學和機械性角膜過敏和焦慮樣行為Figure 2 DED induces chemical and mechanical corneal allergy and anxiety-like behaviour in mice

2.2 柚皮素減輕干眼病引起的角膜疼痛綜合征

評估柚皮素對干眼病的治療效果，結果顯示，DED+NAR 組干眼病小鼠眼瞼閉合時間顯著降低，角膜機械閾值增加，與DED+DMSO 組比較，差異有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01），見圖3-A～B。同時，使用柚皮素治療減少干眼病小鼠角膜傷害感受器敏化，具體表現在對熱和冷觸發的角膜神經活動的作用。結果顯示，于20、31、40 ℃，DED+NAR 組小鼠睫狀神經的誘發活動較DED+DMSO 組顯著下降（P＜0.01），見圖3-C。以上結果表明，柚皮素可減輕干眼病引起的角膜疼痛綜合征。

圖3 柚皮素減輕干眼病引起的角膜疼痛綜合征Figure 3 Naringenin alleviates corneal pain syndrome caused by dry eye disease

2.3 柚皮素減少干眼病小鼠角結膜促炎細胞因子

本研究通過RT-qPCR 法檢測不同處理組小鼠角結膜炎癥因子的表達水平，結果如圖4所示：與sham 組比較，DED 組小鼠角結膜中促炎癥因子IL-1β mRNA、IL-6 mRNA水平顯著上升，抗炎癥因子IL-10 mRNA 水平顯著下降（均P＜0.001）；與DED+DMSO 組比較，DED+NAR 組角結膜上述炎癥因子mRNA 表達水平均出現顯著逆轉（均P＜0.01）。

圖4 柚皮素減少干眼病小鼠角結膜促炎細胞因子Figure 4 Naringin reduces pro-inflammatory cytokines in the cornea of mice with dry eye disease

2.4 柚皮素降低干眼病小鼠三叉神經節CXCL13 mRNA及蛋白表達水平

為探討柚皮素是否通過調節CXCL13 表達緩解干眼病小鼠角膜疼痛，本研究通過RT-qPCR 法檢測CXCL13 mRNA 表達水平，Western Blot 法檢測CXCL13 蛋白表達水平。圖5 結果顯示，DED 組小鼠CXCL13 mRNA 及蛋白表達水平均較sham 組顯著上升（P＜0.001），而DED+NAR 組CXCL13 mRNA 及蛋白表達水平均低于DED+DMSO 組（P＜0.01或P＜0.001）。

圖5 柚皮素降低干眼病小鼠三叉神經節CXCL13 mRNA及蛋白表達水平Figure 5 Naringin reduces mRNA and protein expression levels of CXCL13 in the trigeminal ganglion of mice with dry eye disease

3 討論

干眼病是一種常見的眼部疾病，包括由于眼表炎癥引起的不適、視力障礙和淚膜滲透壓增加等多種癥狀[19]。目前，干眼病機制尚不完全明確。在干眼病中，淚腺和眼表面的穩態維持喪失，使穩定淚膜和保護眼表面的淚膜成分失衡[20-21]。淚液高滲是干眼惡性循環的中心事件之一，導致淚液減少，促進促炎細胞因子、趨化因子和基質金屬蛋白酶的表達和生成[20]。本研究中，柚皮素降低了干眼癥小鼠促炎因子IL-1β、IL-6 mRNA 水平，升高了干眼癥小鼠抗炎癥因子IL-10 mRNA 水平，表明干眼癥小鼠經柚皮素治療后炎癥反應下降。

角膜超敏性、炎癥和自發角膜神經纖維活動之間存在一定的聯系[22]，角膜炎癥參與角膜神經感受器的激活[23]。趨化因子被認為在神經病理性疼痛的發病機理中起著關鍵作用[23]，包括CCL2、CCL7、CXCL1 和CXCL13 在內的幾種趨化因子[24-25]。有研究報道，10種趨化因子（包括CCL2、CCL7、CXCL1和CXCL13）在脊神經結扎后的脊髓中表達增加了3 倍以上，其中，CXCL13 是上調最多的基因，增加了47 倍[25]。本研究結果顯示，干眼病小鼠三叉神經節CXCL13 mRNA 及蛋白表達水平也顯著上調，而柚皮素對CXCL13 mRNA 及蛋白表達水平有一定的抑制作用。

臨床前研究和臨床研究報告了干眼病角膜疼痛與焦慮共病[26]。本研究使用高架十字迷宮和黑白箱試驗對DED 小鼠進行焦慮測試，結果顯示，DED 小鼠出現焦慮行為。這種行為與杏仁核中觀察到的神經元激活有關，使痛覺反應與疼痛的情緒方面之間建立聯系。該發現強調了干眼病對動物神經精神的影響，將會導致疼痛和焦慮。而柚皮素可減輕干眼病引起的角膜疼痛綜合征。

綜上所述，本研究初步探究了柚皮素對干眼病小鼠化學和機械性角膜過敏、焦慮樣行為以及三叉神經節CXCL13 mRNA 及蛋白表達水平的影響。柚皮素可抑制三叉神經節CXCL13表達，從而緩解干眼病引起的角膜疼痛綜合征。