不同造模方法復(fù)制SD大鼠肩周炎模型的比較研究

桑莉莉，吳俊哲，高大偉

（中山市中醫(yī)院骨科，廣東中山 528400）

肩周炎是肩周肌肉、肌腱、滑囊、關(guān)節(jié)囊等軟組織的慢性炎癥，導(dǎo)致盂肱關(guān)節(jié)囊的炎性粘連、僵硬及慢性退變，以關(guān)節(jié)疼痛、活動受限（以外展、外旋和后伸為主）為臨床特征的疾病，多發(fā)于50 歲左右的中老年人，女性發(fā)病率高于男性，左肩多于右肩[1-2]。由于肩周炎的臨床表現(xiàn)復(fù)雜，病程持續(xù)1～2年，甚至治愈后仍遺留肩關(guān)節(jié)功能受限，研究[3]表明，肩周炎主要病理表現(xiàn)為喙肱韌帶、肱二頭肌下滑囊等無菌性炎癥粘連、肌腱組織纖維化增生和變性等；但其具體病理機制尚不明確。因此，越來越多的學(xué)者采用動物模型進行肩周炎的病理機制研究。根據(jù)既往文獻常用的肩周炎動物模型分為以下4 種：風(fēng)寒濕刺激模型[4]、持續(xù)機械勞損加冰敷模型[5]、手術(shù)損傷模型[6]和石膏制動模型[7-8]；但其模型穩(wěn)定性如何尚不清楚。因此，本研究建立以上4 種肩周炎SD 大鼠模型，比較其炎癥以及纖維化的情況，篩選穩(wěn)定有效的造模方法，以期為肩周炎的發(fā)病機制及藥效學(xué)研究提供基礎(chǔ)支撐，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物100只無特殊病原體（SPF）級雄性SD 大鼠，（7 ± 0.5）周齡，體質(zhì)量（0.20～ 0.22）kg，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2018-0001]提供。動物飼養(yǎng)環(huán)境控制在溫度18～ 26 ℃，相對濕度40%～ 70%，噪音85分貝以下，通風(fēng)換氣8～12次/h。本動物實驗方案已通過中山市中醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批號：2023ZSZY-LLK-291）。

1.2 主要試劑與儀器蘇木素-伊紅（HE）染液（武漢谷歌生物科技公司）；兔抗環(huán)氧合酶1（COX-1）抗體、兔抗降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）受體成分蛋白（CRCP）抗體、兔抗泛素羧基末端水解酶（UCHL）抗體（美國Proteintech 公司）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）（美國Abcam 公司）；兔抗轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）抗體（美國Bioss 公司）；山羊抗兔IgG二抗（美國Servicebio 公司）。RM2016 組織切片機（上海徠卡儀器有限公司）；NIKON ECLIPSE CI 正置光學(xué)顯微鏡、NIKON DS-U3成像系統(tǒng)（日本尼康公司）；WD-9405A脫色搖床（北京市六一儀器廠）。

1.3 動物分組與干預(yù)將100 只SD 大鼠隨機分為5組，即風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模型組、石膏制動模型組、空白對照組，每組20只。

風(fēng)寒濕刺激模型[4]：模擬風(fēng)寒濕條件刺激肩關(guān)節(jié)。大鼠肩部局部去毛后，給予中強度風(fēng)、寒、濕連續(xù)刺激（風(fēng)力5級、9～10 ℃、90%濕度，連續(xù)刺激6 h，連續(xù)6 d）。

持續(xù)機械勞損加冰敷模型[5]：用薄剪剃除大鼠右肩部外側(cè)約6 cm × 6 cm 面積大小的毛發(fā)，固定大鼠左前肢和兩后肢，然后連接右前肢與水平搖床。水平搖床采用240 次/min 頻率、1.5 cm 振幅，6 h/d，共3 d。每次機械勞損后，將自制的裝滿冰塊的肩袖袋外敷于大鼠右肩部，6 h/d，共3 d，注意當(dāng)冰塊融化將盡時予更換冰袋。

手術(shù)損傷模型[6]：大鼠麻醉滿意后，采用彎鉗于岡上肌、斜方肌肩峰附著部和三角肌、三角肌下滑囊等處做牽拉及持續(xù)的鈍性摩擦，造成局部瘀腫淤血。

石膏制動模型[7-8]：大鼠麻醉滿意后，將石膏繃帶固定右肩部后伸30°位置（肩關(guān)節(jié)內(nèi)旋位）。每天觀察石膏是否破壞或松動。注意觀察大鼠是否可依靠左前肢爬行、站立以及自主飲食。如有大鼠石膏被破壞或松動，此情況達不到制動效果，需要及時重新制作并更換石膏。

空白對照組不做處理。清潔級條件正常飲食喂養(yǎng)。

1.4 取材造模完成后第1、2、4、8周取材。大鼠麻醉滿意后，將大鼠俯臥固定，暴露右肩關(guān)節(jié)，用薄剪在肩關(guān)節(jié)軟骨組織取材，放置4%多聚甲醛溶液中固定，留待進行HE 染色、免疫組織化學(xué)染色。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 HE 染色法觀察肩關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)形態(tài) 將肩關(guān)節(jié)軟骨組織石蠟切片脫蠟至水。切片入Harris 蘇木素染色3～ 8 min，自來水洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗，0.6%氨水返藍，流水沖洗。切片入伊紅染液中染色1～3 min。脫水透明，中性樹膠封片。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。細胞核呈藍色，細胞質(zhì)呈紅色。

1.5.2 免疫組織化學(xué)染色法檢測肩關(guān)節(jié)軟骨組織炎癥因子（COX-1、TNF-α），纖維化因子（TGF-β），神經(jīng)內(nèi)分泌因子（CRCP、UCHL）表達 將肩關(guān)節(jié)軟骨組織石蠟切片脫蠟至水，EDTA 抗原修復(fù)緩沖液（pH9.0）抗原修復(fù)，3%過氧化氫溶液室溫避光孵育25 min，3%BSA 室溫封閉30 min。分別加一抗COX-1（1∶200）、TNF-α（1∶100）、TGF-β（1∶100）、CRCP（1∶200）、UCHL（1∶500）稀釋液4 ℃孵育過夜，加二抗（1∶500）室溫孵育50 min，DAB 顯色，Harris 蘇木素復(fù)染3 min 左右，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，氨水返藍，脫水透明，中性樹膠封片。每步驟中間要PBS 洗滌3次，每次5 min。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析累積光密度值（IOD）以及組織的像素面積（AREA）。并求出平均光密度（AO）值，AO=IOD/AREA，AO 值越大表示目的蛋白陽性表達水平越高。

1.6 統(tǒng)計方法采用SPSS 21.0 軟件包處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，符合正態(tài)分布，采用方差齊性檢驗，方差齊則采用獨立樣本t檢驗，自身對照均值比較，采用配對t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)比較則采用Mann-WhitneyU非參數(shù)檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組模型大鼠肩關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)形態(tài)比較圖1結(jié)果顯示：與空白對照組比較，風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機械勞損加冰敷模型組肩關(guān)節(jié)軟骨細胞逐漸減少，關(guān)節(jié)表面軟骨逐漸纖維化，手術(shù)損傷模型組肩關(guān)節(jié)軟骨細胞于造模完成后第2 周時增多，然后逐漸減少，關(guān)節(jié)表面軟骨逐漸纖維化，石膏制動模型組肩關(guān)節(jié)軟骨細胞逐漸減少，于造模完成后第8 周時關(guān)節(jié)表面軟骨纖維化，軟骨層增生，未見明顯軟骨下層骨組織細胞。

圖1 各組模型大鼠造模完成后不同時間肩關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)形態(tài)比較（HE染色，×100）Figure 1 Comparison of cartilage histopathological morphology of the shoulder joint at different times after completion of modelling among various model groups of rats（HE staining，×100）

2.2 各組模型大鼠肩關(guān)節(jié)組織炎癥因子（COX-1、TNF-α），纖維化因子（TGF-β），神經(jīng)內(nèi)分泌因子（CRCP、UCHL）表達比較

2.2.1 炎癥因子 圖2 結(jié)果顯示：空白對照組大鼠造模完成后第1～8 周肩關(guān)節(jié)組織COX-1 表達逐漸減少；風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模型組造模完成后第1～4 周COX-1 表達逐漸增加，第4 周達到最高值，至第8 周逐漸減少；石膏制動模型組于造模完成后第1～ 2 周COX-1 表達逐漸增加達到最高，至第4 周降低，第8周逐漸增加。組間比較，風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模刺激組、石膏制動模型組COX-1 表達最高值均高于空白對照組最高值（P＜0.05）。

圖2 各組模型大鼠造模完成后不同時間肩關(guān)節(jié)組織COX-1表達比較Figure 2 Comparison of COX-1 expression in shoulder joint tissue at different times after completion of modelling among various model groups of rats

圖3結(jié)果顯示：空白對照組大鼠造模完成后第1～8 周肩關(guān)節(jié)組織TNF-α 表達逐漸增加；風(fēng)寒濕刺激模型組、石膏制動模型組大鼠造模完成后第1～ 4 周TNF-α 表達逐漸減少，至第8 周表達增加；持續(xù)機械勞損加冰敷模型組大鼠造模完成后第2～8周TNF-α 表達逐漸減少。組間比較：風(fēng)寒濕刺激模型組、手術(shù)損傷模型組第1～2 周TNF-α 表達高于空白對照組，持續(xù)機械勞損加冰敷模型組在第1～ 4 周均高于空白對照組，石膏制動模型組在第1～8 周均高于空白對照組（P＜0.05）。

圖3 各組模型大鼠造模完成后不同時間肩關(guān)節(jié)組織TNF-α表達比較Figure 3 Comparison of TNF-α expression in shoulder joint tissue at different times after completion of modelling among various model groups of rats

2.2.2 纖維化因子 圖4 結(jié)果顯示：空白對照組大鼠造模完成后第1～8 周肩關(guān)節(jié)組織TGF-β 表達逐漸減少；風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模型組、石膏制動模型組TGF-β表達均先增加再降低，均在第2周達到最高值。組間比較，持續(xù)機械勞損加冰敷模型組、石膏制動模型組TGF-β 在第2 周時最高值大于其他各組最高值（P＜0.05）。

圖4 各組模型大鼠造模完成后不同時間肩關(guān)節(jié)組織TGF-β表達比較Figure 4 Comparison of TGF-β expression in shoulder joint tissue at different times after completion of modeling among various model groups of rats

2.2.3 神經(jīng)內(nèi)分泌因子 圖5 結(jié)果顯示：空白對照組大鼠造模完成后第1～ 8 周肩關(guān)節(jié)組織CRCP表達逐漸增加；風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模型組大鼠造模完成后第1～2周CRCP 表達逐漸增加，第2周達到最高值，至第8周逐漸減少；石膏制動模型組大鼠造模完成后第1～ 8 周CRCP 表達逐漸減少。組間比較，風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模型組CRCP 表達在第2 周最高值高于空白對照組（P＜0.05），石膏制動模型組在第1 周最高值高于空白對照組（P＜0.05）。

圖6結(jié)果顯示：空白對照組、風(fēng)寒濕刺激模型組大鼠造模完成后第1～ 2 周肩關(guān)節(jié)組織UCHL 表達先增加，至第4 周再降低，至第8 周再增加；持續(xù)機械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模型組、石膏制動模型組UCHL表達均先增加再減少，持續(xù)機械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模型組在造模完成后第2 周達到最高值，石膏制動模型組在第4 周達到最高值。組間比較，風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模型組、石膏制動模型組大鼠在造模完成后第1、2、4、8 周UCHL表達均高于空白對照組（P＜0.05）。

圖6 各組模型大鼠造模完成后不同時間肩關(guān)節(jié)組織UCHL表達比較Figure 6 Comparison of UCHL expression in shoulder joint tissue at different times after completion of modeling among various model groups of rats

3 討論

肩周炎主要發(fā)病階段分為急性期、慢性期和恢復(fù)期，早期以關(guān)節(jié)囊炎癥為主，慢性期以纖維化為主，恢復(fù)期纖維化自發(fā)消退。本研究中肩關(guān)節(jié)組織HE 染色結(jié)果顯示：風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機械勞損加冰敷模型組肩關(guān)節(jié)軟骨細胞逐漸減少，關(guān)節(jié)表面軟骨逐漸纖維化；手術(shù)損傷模型組肩關(guān)節(jié)軟骨細胞于造模完成后第2周時增多，然后逐漸減少，關(guān)節(jié)表面軟骨逐漸纖維化；石膏制動模型組肩關(guān)節(jié)軟骨細胞逐漸減少，造模完成后第8 周時關(guān)節(jié)表面軟骨纖維化，未見明顯軟骨細胞。表明這4種方法構(gòu)建的肩周炎動物模型均可見關(guān)節(jié)軟骨細胞減少、表面纖維化。

肩周炎是炎癥和纖維化的過程，早期滑膜增生、血管數(shù)量增多，與無菌性炎癥、纖維化過程密切相關(guān)。COX-1 主要參與炎癥和膠原分解代謝過程。TNF-α 為促炎性反應(yīng)細胞因子[9]。有研究[10-11]表明，肩峰下滑囊、關(guān)節(jié)囊中COX-1、TNF-α等炎癥細胞因子的表達增加與肩關(guān)節(jié)的腫痛癥狀以及炎癥轉(zhuǎn)化為纖維化的發(fā)病機制有關(guān)。炎性細胞因子表達增加可誘導(dǎo)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致肩周炎的非自然組織修復(fù)和纖維化。本研究結(jié)果顯示：風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模型組、石膏制動模型組COX-1 表達在造模完成后第1～ 8 周最高值均高于空白對照組最高值。風(fēng)寒濕刺激模型組、手術(shù)損傷模型組TNF-α 表達在造模完成后第1～2 周高于空白對照組，持續(xù)機械勞損加冰敷模型組TNF-α表達在造模完成后第1～ 4 周均高于空白對照組，石膏制動模型組TNF-α表達在造模完成后第1～8周均高于空白對照組。故石膏制動模型在炎癥因子表達穩(wěn)定性方面優(yōu)于風(fēng)寒濕刺激模型、持續(xù)機械勞損加冰敷模型、手術(shù)損傷模型。

TGF-β 作為生長與分化因子可調(diào)節(jié)生長、發(fā)育、炎癥、修復(fù)和免疫等生物學(xué)過程，可促進成纖維細胞合成膠原蛋白、纖維黏連蛋白及蛋白多糖等細胞外基質(zhì)，還可促進上皮細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細胞，可直接促進成纖維細胞合成膠原，并使組織間上皮細胞相互識別或通過促使巨噬細胞分泌成纖維細胞生長因子，進一步促進成纖維細胞合成和分泌膠原纖維，而當(dāng)膠原纖維過度沉積時就會導(dǎo)致瘢痕組織和粘連的形成[12-13]。Redeo 等[14]研究表明，TGF-β 對肩周炎患者滑膜增生和關(guān)節(jié)纖維化有重要作用。本研究結(jié)果顯示：風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模型組、石膏制動模型組TGF-β 表達均先增加再降低，均在造模完成后第2周達到最高值，持續(xù)機械勞損加冰敷模型組、石膏制動模型組TGF-β表達在造模完成后第2周時最高值大于其他各組最高值。故持續(xù)機械勞損加冰敷模型、石膏制動模型在肩關(guān)節(jié)纖維化相關(guān)因子穩(wěn)定表達方面優(yōu)于風(fēng)寒濕刺激模型、手術(shù)損傷模型。

有研究[15]表明，神經(jīng)和血管因素與肩周炎的發(fā)病過程亦相關(guān)，CGRP 分布在血管周圍或成纖維細胞中，其表達增加可造成血管增多、滑膜囊增厚和攣縮。CGRP 作為促炎癥性神經(jīng)肽，在疼痛感覺傳遞中起重要作用[16]。UCHL 為泛素C 末端水解酶在神經(jīng)元中高表達，參與調(diào)解蛋白的聚集并維持其穩(wěn)定，UCHL 缺失可導(dǎo)致神經(jīng)元細胞凋亡[17]。本研究結(jié)果顯示：風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模型組CRCP 表達在造模完成后第2周最高值高于空白對照組，石膏制動模型組在造模完成后第1 周最高值高于空白對照組。風(fēng)寒濕刺激模型組、持續(xù)機械勞損加冰敷模型組、手術(shù)損傷模型組、石膏制動模型組在造模完成后1～ 8 周UCHL 表達均高于空白對照組。表明手術(shù)損傷模型和石膏制動模型在肩關(guān)節(jié)致痛因子表達方面優(yōu)于風(fēng)寒濕刺激模型、持續(xù)機械勞損加冰敷模型。

綜上所述，針對肩周炎的4種SD大鼠模型——風(fēng)寒濕刺激模型、持續(xù)機械勞損加冰敷模型、手術(shù)損傷模型、石膏制動模型，研究者可根據(jù)不同的實驗研究目的進行選擇。