烙灸介導Wnt信號通路對脊髓損傷大鼠內源性神經干細胞增殖分化影響

夏鉑 范靈

【摘 要】目的：探究烙灸介導 Wnt信號通路對脊髓損傷大鼠內源性神經干細胞增殖分化影響。方法：采用Allen’s法制備脊髓損傷大鼠模型。分為假手術組、模型組、Wnt抑制劑組、烙灸組、烙灸聯合Wnt抑制劑組，取損傷大鼠脊髓組織。采用運動神經功能評分（CBBB評分）、免疫組化、免疫熒光法檢測脊髓組織內源性神經干細胞、神經元細胞及星形膠質細胞的標記物。結果：BBB評分、免疫組化、免疫熒光法檢測結果均顯示烙灸組最顯著，Wnt抑制劑組與模型組差異無統計學意義。結論：烙灸激活脊髓損傷大鼠Wnt信號通路，促進其內源性神經干細胞增殖分化為神經元細胞，抑制分化為星形膠質細胞，使其神經細胞修復再生。

【關鍵詞】Wnt信號通路；烙灸；脊髓損傷大鼠；內源性神經干細胞；增殖分化

【中圖分類號】R245.82 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2023）16-0011-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.16.zgmzmjyyzz202316004

Effect of LaoMoxibustion Mediated Wnt Signal Pathway on Proliferation and Differentiation of Endogenous Neural Stem Cells in Rats with Spinal Cord Injury

XIA Bo FAN Ling*

Ningxia Medical University，Yingchuan 750004，China

Abstract： Objective To explore the effect of lao moxibustion mediated Wnt signal pathway on the proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells in rats with spinal cord injury.Methods Allen’s method was used to prepare the rat model of spinal cord injury.They were were divided into sham operation group，model group，Wnt inhibitor group，lao moxibustion group，lao moxibustion+Wnt inhibitor group.Basso Beattie Bresnahan（BBB） score，immunohistochemistry and immunofluorescence were used to detect the markers of endogenous neural stem cells，neuron cells and astrocytes in spinal cord tissue.Results BBB score，immunohistochemistry and immunofluorescence test results all showed that lao moxibustion group was the most significant，and there was no significant difference between the Wnt inhibitor group and the model group.Conclusion Lao moxibustion activated Wnt signaling pathway in rats with spinal cord injury，promoted the proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells into neurons，inhibited the differentiation into astrocytes，and made the repair and regeneration of nerve cells.

Key words： Wnt Signal Path; Lao Moxibustion; Spinal Cord Injury Rat； Endogenous Neural Stem Cells; Proliferation and Differentiation

脊髓損傷作為一種嚴重創傷性事件，在交通、勞動及運動事故中較為常見，導致中樞神經系統致殘損傷。常造成損傷部位以下運動、感覺等功能不可逆轉喪失，同時引起肌肉萎縮、壓瘡、感染，嚴重導致呼吸障礙［1-2］。脊髓損傷臨床手段很多，如手術療法、大劑量激素沖擊療法、理療康復等［3］。但損傷后中樞神經細胞完全恢復很難，這些治療方法只能減少繼發性脊髓損傷發生，防止脊髓功能進一步惡化，恢復不了已損傷神經恢復功能。因此，研發一些行之有效治療促進脊髓損傷處神經細胞修復再生，以恢復脊髓結構及功能是臨床急需解決問題。烙灸是脊髓損傷一種新療法，臨床已經取得一定療效。前期觀察烙灸對脊髓損傷大鼠Wnt信號通路作用。發現烙灸能激活Wnt信號通路［4］，而Wnt信號通路能促進多種來源干細胞發生神經分化［5］。此外，Wnt信號通路是調控內源性神經干細胞主要通路［6］。本人提出烙灸激活脊髓損傷大鼠Wnt信號通路，促進其內源性神經干細胞增殖分化為神經元細胞，同時抑制分化為星形膠質細胞，使其神經細胞修復再生。為驗證假說，故設計本實驗，揭示其機理，為臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年雄性（Sprague Dawley，SD）大鼠50只，SPF級，體質量240～290 g，來自寧夏醫科大學實驗動物中心。大鼠在安靜環境下飼養，給予充足飼養和飲用水，室溫20～22 ℃，相對濕度45%，保持動物房內晝夜節律。動物實驗嚴格遵循3R原則。實驗方案經寧夏醫科大學倫理研究原著委員會批準。

1.1.2 試劑 與儀器巢蛋白抗體（Nestin，DF7754，Affinity），神經膠質纖維酸性蛋白抗體（Glial Fibrillary Acidic Protein，#80788，Cell Signaling Technology），封閉液（濃縮型正常山羊血清，中杉金橋），光學顯微鏡 （LEICA，德國）、Image-lab圖像分析系統和Image-Pro 圖像分析系統（BIORADHERCULES，美國）。石蠟切片機（RM2235，Leica公司，德國），全波長酶標儀（Epoch，Biotek公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 脊髓損傷模型 大鼠制備除假手術組外，其他4組大鼠均采用水合氯醛腹腔麻醉，俯臥位固定于大鼠固定器上，椎板咬骨鉗咬去T9～T11棘突和椎板，充分露出脊髓組織，避免損傷硬脊膜。運用改良自制Allen’s大鼠脊髓損傷打擊裝置，使打擊棒套入鋼管內，通過砝碼測量打擊棒打擊重量達10 g，打擊高度5 cm，打擊棒自由下落，致使T9～T11節段急性脊髓損傷（不完全性癱大鼠脊髓損傷模型，屬中等程度損傷）。大鼠有擺尾反射，雙下肢癱瘓證實造模成功。假手術組只做椎板切除，不損傷脊髓。術后大鼠分籠，飼養于配有空調專用室，注意術后護理防止感染，每日按壓膀胱區排尿3次，保持墊料干燥。觀察記錄大鼠雙后肢活動情況、立足伸趾能力、回縮反射、大小便等狀態。模型的建立參照《藥理實驗方法學》［7］及相關文獻的方法造模。

1.2.2 實驗分組及造模干預 隨機將50只SD大鼠分為5組，假手術組：只做椎板切除，不做脊髓損傷。模型組：只造模。Wnt抑制劑組：造模成功后12 h給予Wnt抑制劑腹腔注射給藥，每日1次，持續28 d。烙灸組：造模成功后12 h后采用烙灸治療，烙灸組造模后每日同一時間重復治療一次，持續28 d。烙灸聯合Wnt抑制劑組：造模成功后12 h給予Wnt抑制劑腹腔注射給藥，同Wnt抑制劑組，并采用烙灸治療，同烙灸組，持續28 d。烙灸干預：在損傷大鼠兩側夾脊穴（在距損傷上下端兩個椎體棘突間隙旁開距中線3～4 mm處夾脊穴）上，用特制烙灸器，W形薄鐵皮制作灸槽，帶有手柄，依據損傷脊柱長度制作，放于損傷脊柱上，在灸槽內放入艾絨點燃，艾絨加熱傳導鐵器，鐵器傳導患處，使局部發熱，嚴格觀察皮膚情況，造模后每日1次，每次5 min。

1.2.3 標本采集與處理 干預28 d，將大鼠采用全身灌注多聚甲醛取材，以損傷脊髓為中心取縱向離損傷點長約1 cm脊髓，制成石蠟包塊用于免疫組化、免疫熒光檢測損傷組織內源性神經干細胞標記物-神經絲巢蛋白（Nestin）、神經元細胞標記物-神經元特異性稀醇化酶（neuron specific enolase，NSE）和星形膠質細胞標記物-膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）。

1.2.4 脊髓損傷運動功能（basso beattie bresnahan，BBB）評分［8］ 兩名不知道實驗分組觀察者，于造模后第3天、7天、14天、28天運用BBB運動評定量表評估各組大鼠后肢運動情況，評估指標主要包括各個關節活動情況、跨步能力以及其協調性與軀干平衡能力等，0分（無運動功能）至21分（正常運動功能），兩人背向評估，平均值是大鼠運動功能最終得分。

1.2.5 免疫組化檢測 將石蠟切片脫蠟入水，經二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水，利用檸檬酸進行微波修復抗原、內源性過氧化物酶阻斷、血清封閉后滴加Nesti（1∶250），GFAP（1∶400），β-Catenin（1∶400）和GSK-3β（1∶400），4℃過夜；第2天，PBS漂洗后加入二抗孵育40 min，PBS漂洗后DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，沖洗返藍，脫水、透明、中性樹膠封固，顯微鏡下觀察并拍片。

1.2.6 免疫熒光檢測 切片常規脫蠟至水，將切片置于EDTA抗原修復液，微波爐中高火加熱至沸騰，室溫冷卻5 min后，再中高火加熱3 min，再自然冷卻至室溫。滴加山羊血清封閉液（原液用PBS按1∶9稀釋），37℃孵育30 min。甩去多余液體，不洗。實驗片滴加適當稀釋的一抗，4℃過夜。取出后37℃復溫30 min，PBS（pH 7.2～7.6）洗5 min，3次。滴加DyLight488熒光素標記羊抗兔IgG，37℃ 孵育45 min。PBS（pH 7.2～7.6）洗5 min，3次。滴加DAPI染色液，室溫孵育3 min。PBS（pH 7.2～7.6）清洗?？篃晒獯銣绶馄瑒┓馄?。熒光顯微鏡觀察結果及拍照。采用ImageJ軟件分析各個單位視野內大鼠脊髓組織Nestin、NSE、GFAP陽性細胞數。

1.3 統計學處理 采用SPSS 20.0軟件進行實驗數據的統計分析，采用Graphpad Prism 8.0軟件進行圖的繪制。定量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BBB運動功能評分結果 假手術組大鼠運動功能正常。第3天評分：模型組、Wnt抑制劑組、烙灸組、烙灸聯合Wnt抑制劑組大鼠運動功能評分均小于7分，差異無統計學意義（P>0.05）。第7、14天評分：烙灸組、烙灸聯合Wnt抑制劑組評分高于模型組、Wnt抑制劑組，差異有統計學意義（P<0.05）。Wnt抑制劑組與模型組差異無統計學意義（P>0.05）。第21天評分：烙灸組>烙灸聯合wnt抑制劑組>模型組>Wnt抑制劑組。Wnt抑制劑組與模型組差異無統計學意義（P>0.05）。烙灸聯合Wnt抑制劑組較烙灸組評分降低，差異有統計學意義（P<0.05）；第28天評分：烙灸組最高，Wnt抑制劑組最低，差異有統計學意義（P<0.05），Wnt抑制劑組與模型組差異無統計學意義（P>0.05）。見表1，如圖1。

2.2 免疫組化檢測結果 累積光密度值統計假手術組大鼠脊髓組織中Nestin累積光密度值為0。其余4組大鼠脊髓組織中Nestin累積光密度值都較假手術組顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）。Wnt抑制劑組與模型組差異無統計學意義（P>0.05）。烙灸組、烙灸聯合Wnt抑制劑組與模型組、Wnt抑制劑組相比明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。烙灸聯合Wnt抑制劑組與烙灸相比明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。模型組、Wnt抑制劑組、烙灸組及烙灸聯合Wnt抑制劑組大鼠脊髓組織中NSE累積光密度值較假手術組顯著減少，尤其是模型組、Wnt抑制劑組減少幅度最大，差異有統計學意義（P<0.05）。Wnt抑制劑組與模型組差異無統計學意義（P>0.05）。烙灸聯合Wnt抑制劑組與烙灸組相比降幅明顯，差異有統計學意義（P<0.05）。模型組、Wnt抑制劑組、烙灸組及烙灸聯合Wnt抑制劑組大鼠脊髓組織中GFAP累積光密度值較假手術組顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）。Wnt抑制劑組與模型組差異無統計學意義（P>0.05）。烙灸組、烙灸聯合Wnt抑制劑組較模型組、Wnt抑制劑組減少，差異有統計學意義（P<0.05）。烙灸聯合Wnt抑制劑組較烙灸組高，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2，如圖2。

2.3 免疫熒光檢測結果 免疫熒光檢測Nestin、NSE、GFAP陽性細胞數Nestin、NSE、GFAP陽性細胞呈綠色，形態樹枝狀。Nestin假手術組無陽性細胞。NSE、GFAP假手術組陽性細胞數較多，亮度較亮。其余4組大鼠脊髓組織中Nestin陽性細胞數較假手術組顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）。Wnt抑制劑組與模型組差異無統計學意義（P>0.05）。烙灸組、烙灸聯合Wnt抑制劑組與模型組、Wnt抑制劑組相比明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。烙灸聯合Wnt抑制劑組與烙灸組相比明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。模型組、Wnt抑制劑組、烙灸組及烙灸聯合Wnt抑制劑組大鼠脊髓組織中NSE陽性細胞數較假手術組顯著減少，模型組、Wnt抑制劑組減少幅度最大，差異有統計學意義（P<0.05）。Wnt抑制劑組與模型組差異無統計學意義（P>0.05）。烙灸聯合Wnt抑制劑組與烙灸組相比降幅明顯，差異有統計學意義（P<0.05）。模型組、Wnt抑制劑組、烙灸組及烙灸聯合Wnt抑制劑組大鼠脊髓組織中GFAP陽性細胞數較假手術組明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。Wnt抑制劑組與模型組差異無統計學意義（P>0.05）。烙灸組、烙灸聯合Wnt抑制劑組較模型組、Wnt抑制劑組數值減少，差異有統計學意義（P<0.05）。烙灸聯合Wnt抑制劑組較烙灸組高，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3，如圖3。

3 討論

3.1 關于烙灸治療脊髓損傷研究 脊髓損傷是導致截癱主要原因，全世界平均每年每百萬人中有15～40人發生脊髓損傷。給傷者、家庭及社會帶來沉重負擔，但至今未找到確切、有效治療方法［9］。研究證實脊髓損傷后神經細胞仍存在一定修復再生能力，而成年哺乳動物脊髓損傷后神經很難修復再生。中醫學認為脊髓損傷是督脈損傷，致使氣血逆亂，阻滯經絡，氣血不能溫煦濡養肢體導致氣血不足，筋脈瘀阻。治宜補氣、活血、通絡。烙灸是寧夏少數民族醫學中一種簡單、方便、安全、有效的療法，也是中醫學“化膿灸”發展及延續，其操作比“化膿灸”簡便，其透熱力強，造成皮膚損傷程度小。而脊髓損傷病機是元陽不足，氣滯血瘀，寒凝閉阻經絡致使肢體屈伸不利。需要通過強力熱效應刺激周圍神經敏感度，加強其與大腦中樞神經聯系。烙灸具有強力熱效應，正有此功效。其能夠振奮元陽、溫通經脈、化瘀消腫、寒濕祛濕、通經活絡而調整人體氣機稟性［10］。研究［11］表明，烙灸能夠打開藥物或熱力至皮膚內組織通道，起到消炎、鎮痛、增加血液循環、增強機體代謝作用。前期臨床觀察也證實烙灸治療脊髓損傷患者能明顯提高肌力，促進脊髓損傷患者康復［12］。

3.2 各組大鼠實驗結果 分析前期實驗研究［4］發現，烙灸可以調節Wnt信號通路，對大鼠脊髓損傷后神經具有修復再生作用。本實驗采用BBB運動神經功能評分法、免疫組化、免疫熒光法檢測脊髓損傷大鼠脊髓組織內源性神經干細胞標記物（Nestin）、神經元細胞標記物（NSE）、星形膠質細胞標記物（GFAP）。其中BBB評分法是一種定量、客觀檢測技術，能夠對脊髓損傷作出功能性診斷及定量分析。結果顯示：BBB運動神經功能評分，烙灸組>烙灸聯合Wnt抑制劑組>模型組>Wnt抑制劑組，推斷烙灸組、烙灸聯合wnt抑制劑組效果明顯優于模型組、Wnt抑制劑組，且烙灸組療效最顯著，Wnt抑制劑組與模型組差異無統計學意義（P>0.05）。神經絲巢蛋白（Nestin）是一種細胞骨架蛋白，表達于細胞質中，生存于神經上皮干細胞內，與神經干細胞發育及分化息息相關。其發育期時，Nestin表達逐漸增強，而隨著神經干細胞分化結束，Nestin表達也隨之下降，Nestin被認為是內源性神經干細胞主要標記物之一，檢測Nestin能夠鑒定處于分化期內源性神經干細胞［13］。正常脊髓組織內也存在一定量內源性神經干細胞，在非病理情況下，成年動物（神經細胞分化結束）體內內源性神經干細胞處于“靜止狀態”。研究表明在大鼠出生后6 d脊髓組織中Nestin陽性表達消失。本實驗結果證實，假手術組大鼠脊髓組織中Nestin亦累積光密度值及陽性細胞數為0，表明假手術不會引起內源性神經干細胞激活。而大鼠脊髓損傷后Nestin累積光密度值及陽性細胞數顯著升高，它主要集中在損傷部位，可見脊髓損傷能夠激活內源性神經干細胞，導致內源性神經干細胞向損傷部位遷移。烙灸組大鼠脊髓組織中Nestin累積光密度值及陽性細胞數升高趨勢與模型組相似，但是烙灸組大鼠脊髓組織中Nestin累積光密度值及陽性細胞數都較模型組有顯著升高，可見烙灸能夠促進脊髓損傷后損傷局部內源性神經干細胞激活、遷移與增殖。而Wnt抑制劑組與模型組相比，雖無統計學意義，但Wnt抑制劑組值低于模型組，說明Wnt通路被抑制情況下，內源性神經干細胞激活程度明顯減低。反過來說明激活Wnt通路，有助于內源性神經干細胞激活。烙灸聯合Wnt抑制劑組升高值低于烙灸組，也證實這一點。NSE（神經元特異性稀醇化酶）是神經元細胞特異性標志物，脊髓損傷后大量神經元細胞調亡，如何補充替代缺失神經元細胞是治療關鍵。在脊髓組織自我修復過程中，無外界干預情況下，僅少數內源性神經干細胞會分化為神經元細胞［14］。本實驗結果也證明，損傷引起脊髓組織中NSE累積光密度值及陽性細胞數下降，模型組大鼠脊髓組織NSE累積光密度值及陽性細胞數急速減少，而其經過烙灸治療后，損傷局部NSE累積光密度值及陽性細胞數較模型組顯著升高，表明烙灸組對損傷局部神經元細胞具有促進其修復及增生功效。而Wnt抑制劑組值低于模型組，說明Wnt通路被抑制情況下，神經元細胞修復及增生能力降低。反過來說明激活Wnt通路，可促進神經元細胞修復及增生。烙灸聯合Wnt抑制劑組值低于烙灸組，也證實這一點。GFAP（膠質纖維酸性蛋白）是星形膠質細胞骨架蛋白，和星形膠質細胞運動及形狀調節密切相關，其是星形膠質細胞特異性標記物。發育期時，星形膠質細胞可誘導神經元突起定向生長。成年動物體內星形膠質細胞又具有支持、營養、隔離及保護神經元細胞作用。然而，當中樞神經系統損傷后，星形膠質細胞反應性增生，其過度增生會形成膠質瘢痕，同時分泌抑制性分子，影響神經細胞修復再生［15］。結果顯示，脊髓損傷后局部GFAP累積光密度值及陽性細胞數就顯著增多。而烙灸組GFAP累積光密度值及陽性細胞數損傷后也有增加，但其表達都較模型組顯著減少。據此可知，烙灸可能抑制脊髓損傷后損傷局部星形膠質細胞過度增生，減少瘢痕組織的形成，從而促進軸突再生。而且相關研究［16］已證實，降低GFAP累積光密度值及陽性細胞數能減少膠質瘢痕形成，使軸突得以生長及修復，降低對神經細胞損害，從而促進脊髓損傷大鼠肢體運動功能恢復。而Wnt抑制劑組值高于模型組，說明Wnt通路被抑制情況下，減少膠質瘢痕形成能力減弱。反過來說明激活Wnt通路，可減少膠質瘢痕形成。烙灸聯合Wnt抑制劑組值高于烙灸組，也證實這一點。

綜上所述，烙灸有利于脊髓損傷大鼠神經功能恢復，通過激活脊髓損傷大鼠Wnt信號通路，促進其內源性神經干細胞增殖分化為神經元細胞，同時抑制分化為星形膠質細胞，使其神經細胞修復再生。

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