基于數據挖掘和網絡藥理學探討川貝母治療肺系疾病的核心中藥和機制

李丁艾,孫兆泉,尚軍,3*

(1.青海師范大學生命科學學院,西寧 810008; 2.青海師范大學,青藏高原藥用動植物資源重點實驗室,西寧 810008; 3.青海師范大學,高原科學與可持續發展研究院,西寧 810008)

在宏觀層面,數據挖掘是從龐大、復雜的隨機不完全數據中提取隱形、有用、可信信息的有力手段[1-3]。中國古代醫藥典籍蘊含著大量古人用藥隱形而又非常有效實用的用藥規律,揭示古籍中藥處方配伍規律,明確用藥辯證關系,有利于指導現代中藥臨床用藥和中藥新藥配方研究[4-6]。在微觀層面,利用網絡藥理學探究藥物疾病之中的靶點信息蛋白、預測所具功能和作用通路,可以對藥物治療疾病的作用機制更加深入認知,這也與中藥多通路多靶點發揮作用理念相符合[7-8]。例如,Ma等[9]利用數據挖掘確定了3個治療直腸癌氣血兩虛癥核心處方,進一步利用網絡藥理學和分子接技術對核心處方的潛在機制進行探究,發現治療過程中涉及的最重要途徑是有絲分裂原-活化蛋白激酶(MAPK)級聯反應、白細胞介素-17、腫瘤壞死因子(TNF)和血管內皮生長因子(VEGF)途徑。李澤宇等[10]通過數據挖掘技術發現茯苓、黃柏、牛膝等八種中藥常用于治療痛風,且這八種中藥在治療痛風過程中涉及癌癥通路、糖尿病并發癥中的高級糖基化終末產物-受體(advanced glycation end products-receptor for AGE,AGE-RAGE)信號通路等,這些技術的結合使用有利于闡述中藥和疾病的關系,從而加深對中藥機制的理解。

中藥川貝母(FritillariaecirrhosaeBulbus)為百合科植物川貝母(FritillariacirrhosaD.Don)、暗紫貝母(FritillariaunibracteataHsiao et K.C.Hsia)、甘肅貝母(FritillariaprzewalskiiMaxim.)或梭砂貝母(FritillariadelavayiFranch.) 的干燥鱗莖,味苦、甘,性微寒;歸肺、心經;主治清熱潤肺,化痰止咳;用于肺熱燥咳,干咳少痰,陰虛勞嗽,咯痰帶血[11]。現代藥理學實驗證明貝母生物堿具有鎮咳抗炎、降壓、增強心肌收縮力、抗腫瘤、抗菌作用[12-13]。采用數據挖掘的方法對貝母治療肺系病方劑進行分析,研究其配伍應用規律,進一步利用網絡藥理學分析,分析核心藥對治療支氣管哮喘的作用機理,為貝母治療肺系疾病方劑中的應用規律研究提供依據,為其臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 方劑篩選

以方劑組成含“貝母”,主治或功效含“咳嗽”“肺熱”“肺咳”“咳”“喘”“哮”“肺脹”“肺絡張”“肺痿”“肺癰”“肺癆”“肺癌”“肺水”“肺厥”“肺衰”“塵肺”“懸飲”“干肋痛”等為檢索條件[14],運用《中醫資源網》中醫藥數據庫方劑數據庫檢索模塊收集含貝母的處方。去重,篩選出含貝母處方420個,涉及中藥463味。

1.2 中藥名稱規范與錄入

參考2020版《中國藥典》(一部)及《中華本草》對處方涉及中藥名稱進行規范,藥材相同但產地不同的藥物名稱統一,如“貝母”統一為“川貝母”;“土貝母”“象貝母”統一為“浙貝母”;“牛黃”“西牛黃”統一為“牛黃”。炮制后藥材性味歸經及主治功效有較大變化的保留炮制名稱,如“生地黃” 甘,寒,歸心、肝、腎經,清熱涼血,養陰,生津;“熟地黃” 甘,微溫,歸肝、腎經,滋陰補血,益精填髓。

1.3 用藥頻次與關聯規則

1.3.1 數據篩選

建立“處方-組分”Excel 2010數據庫,運用數據透視表構建藥物頻次矩陣,篩選使用頻次≥30的藥物為高頻藥物。

1.3.2 高頻藥物藥性分析

以2020版《中國藥典》和《中華本草》記載藥物性味歸經,構建高頻藥物性、味、歸經Excel數據庫。錄入原則,如單味藥具有多個藥味,則全部統計錄入,如“川貝母”味甘、苦,則“甘”和“苦”均作統計;單味藥具有多個歸經,全部統計錄入,如“川貝母”歸肺、心經,則“肺經”和“心經”均作統計;藥物四氣歸類將“微寒”歸屬為“涼”,“微熱” 歸屬為“溫”。并構建頻次矩陣。

1.3.3 高頻藥物功效分類分析

以2020版《中國藥典》《中華本草》及《中藥學》記載中藥主治功效,構建高頻藥物功效Excel數據庫,檢索錄入藥物二級功效,如“羌活”為“解表藥”類項下“辛溫解表藥”。

1.3.4 高頻藥物關聯規則

對使用頻次≥30的高頻次藥物,經SPSS Modeler 14.1進行關聯規則分析,構建藥物之間關聯網絡,并利用Apriori 建模進一步挖掘出藥物之間的配伍關系,設置最低條件支持度為10%,最小規則置信度為80%,最大前項數為5,增益及提升度不小于1為關聯條件篩選核心藥物組合。

提升度=置信度(前項/后項)/后項總概率

1.4 網絡藥理學

支氣管哮喘(bronchial asthma,BA)為一個典型肺系病,以核心藥對治療BA作為例子進行研究。

1.4.1 核心藥對活性成分篩選及靶點預測

利用中藥系統藥理學數據庫及分析平臺TCMSP[15](https://tcmspw.com/)檢索核心藥對的所有化學成分,基于藥代動力學(absorption,distribution,metabolism,excretion,ADME)參數選取有效活性成分 (篩選條件為口服生物利用度≥30%,類藥性≥0.18)及相應靶點,采用 UniProt(https://sparql.uniprot.org/)數據庫矯正靶點的基因名。

1.4.2 支氣管哮喘的靶點篩選

基于GeneCards數據庫 (https:/www.genecards.org/) 數據庫,將“bronchial asthma”作為檢索詞以預測目前已知的與BA相關的潛在靶點。

1.4.3 PPI網絡的構建

利用Venny2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)繪制藥物及疾病靶點韋恩圖,獲取“藥物-疾病”的交集靶點,將交集靶點導入 STRING 數據庫[16](http://string-db.org/cgi/input.pl),選擇“Multiple Proteins”,設定基因來源為“homo sapiens”,構建蛋白互作網絡(protein-protein interaction network,PPI),下載以string_interations命名的.tsv文檔,再將文檔數據導入數據可視化處理軟件Cytoscape 3.9.1,借助CytoNCA 插件計算出介數中心度(degree centrality),根據度值篩選關鍵靶點。

1.4.4 “核心藥物-成分-靶點-疾病通路”網絡構建

利用數據可視化處理軟件 Cytoscape3.9.1構建“藥物-成分-靶點-疾病通路”網絡圖。節點(node)代表藥物成分、靶點、藥物及疾病名稱,邊(edge)代表各中藥與活性成分、活性成分與靶點、疾病與靶點的相互作用關系,并應用 Cytoscape3.9.1 軟件中的 CytoNCA插件獲取位居前 5 的關鍵成分,用于后續驗證。

1.4.5 GO與KEGG通路富集分析

將關鍵靶點導入 DAVID 數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)中,閾值設為P<0.05,進行GO功能富集和 KEGG 通路富集分析,探究BA核心靶點在生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細胞組分(cellular component,CC)方面涉及的功能及通路并借助微生信網站(http://www.bioinformatics.com.cn/)對結果進行可視化繪圖。

1.5 分子對接驗證

從PDB(https://www.rcsb.org/)數據庫下載靶點的 PDB 文件,利用 PYMOL 對受體蛋白進行去水、去配體等操作,從 PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫下載活性成分 SDF 文件,運用openbabel 軟件轉換為 Mol2 格式文件,利用 AutoDock-Tools-1.5.6 對受體蛋白及配體進行加氫、平衡電荷等操作,保存為pdbqt 格式文件,并運用AutoDock-Tools-1.5.6 對處理好的活性化合物與靶蛋白進行對接及能量計算,利用Autodock Vina 1.1.2 軟件對處理后的化合物與靶標進行對接,PyMOL 軟件用于可視化關鍵化合物和蛋白質靶標對接結果。

2 結果與分析

2.1 數據挖掘結果

2.1.1 用藥頻次分析

將篩選出的貝母處方中的全部藥物進行頻次分析,結果顯示總計463味中藥,累計頻次為5 033次,其中頻次≥30的藥物有35味,累計頻次2 944次,見表1。其中含“川貝母”藥方411個占97.9%,說明川貝母較浙貝母在治療肺系疾病方面更具有顯著療效,對其用藥規律的深度挖掘,更具有開發前景和意義。

表1 含貝母肺系病處方中高頻次單味中藥(頻次≥30)

2.1.2 含貝母肺系疾病中藥組方核心藥物組合分析

基于關聯規則分析,構建高頻藥物網絡關聯圖及Apriori模型,設置支持度為10%,最小置信度80%,最大前項數5為條件挖掘出含川貝母治療肺系相關疾病中藥方劑中潛在的藥物組合,共得到核心藥物組合70組,其關聯規則網絡可視化展示如圖1所示。其中增益及提升度均大于1,具有藥物組合統計學意義的藥物組合43對,如表2～表4所示。

圖1 含川貝母治療肺系疾病高頻藥物(頻次≥30)關聯網絡化展示

表2 含貝母肺系疾病中藥處方高頻核心二聯藥物組合

表3 含貝母肺系疾病中藥處方高頻核心三聯藥物組合

表4 含貝母肺系疾病中藥處方高頻核心四聯藥物組合

2.1.3 含貝母肺系疾病中藥組方核心藥物組合聚類分析

經SPSS Statistics 25統計軟件對高頻藥物(頻次≥30)進行系統聚類分析,數據錄入格式采用如下方法,即用“1”和“0”表示某味藥在某一藥方中的存在與否,編制Excel表格。結果當截距為19.0時,共得到8類,如圖2所示,具體分類見表5。

圖2 含貝母肺系疾病核心藥對聚類分析樹狀圖

表5 含川貝母治療肺系疾病高頻藥物系統聚類分析

表6 活性成分與對應靶點分子對接結果

2.2 網絡藥理學結果

2.2.1 核心藥物及BA相關靶點的篩選

將經2.1.2節分析可得的核心藥對“川貝母-人參”導入到TCMSP數據庫進行活性成分和成分靶點篩選,去重,獲得34個活性成分,101個成分靶點。將“bronchial asthma”作為檢索詞在GeneCards數據庫獲得2 487個疾病靶點。

2.2.2 Hub靶點篩選及PPI網絡構建

將藥物的成分靶點和疾病靶點導入到Venny2.1.0在線平臺,獲得藥物與疾病交集靶點共70個,并制作韋恩圖如圖3所示。再將交集靶點導入到String 平臺,下載蛋白質互作分析(protein protein interaction,PPI)的TSV數據文件,導入到 Cytoscape3.9.1 軟件中獲得蛋白互作網絡圖,如圖4所示。可知共有70個節點,527條邊。借助CytoNCA 插件計算出度值,根據度值篩選Hub靶點。通過構建PPI網絡,可知排名前5的Hub靶點包括“AKT1”“PTGS2”“IL1B”“JUN”“PPARG”。其中PTGS2和JUN為兩味藥材所共有的靶點。AKT1基因編碼的是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,可通過磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)依賴的機制被胞外信號激活,為PI3K信號通路中下游最重要因子,對于肺部疾病具有調節纖維化的作用。Lu等[17]證明了 PI3K/Akt 通過上調細胞生長和膠原蛋白表達在博萊霉素誘導的人肺成纖維細胞的纖維化中起重要作用。經研究PI3K/Akt/mTOR 通路被認為與氣道炎癥密切相關,并受各種上游蛋白的調節[18],當哮喘小鼠中支氣管上皮細胞特異性Brg1敲除后,哮喘嚴重程度得到改善,PI3K/Akt/mTOR通路被激活。通過比較哮喘模型組大鼠、治療組大鼠和陽性組大鼠中PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達[19],發現模型組PI3K、Akt蛋白表達顯著增加,而治療組和陽性組中PI3K、Akt蛋白表達明顯下降,故PI3K/Akt通路可以看作治療支氣管哮喘的重要通路,AKT1也為其重要靶點之一。PTGS2是編碼前列腺素內過氧化物合酶(PTGS)同工酶之一,也叫做環氧合酶2(COX-2)[20],表達部位包括大部分組織間的滑膜細胞,正在排卵的濾泡,在絕大多數被生長因子、細胞因子、佛波酯或激素刺激的組織,抑制糖皮質激素,作為“炎癥反應基因”,有炎癥時會產生前列腺素,調控有絲分裂,參與細胞生長,在調節排卵時起信號作用。經研究可知過敏性哮喘可使氣管壁內平滑肌肥大,致敏肥大細胞β-己糖氨酸酶的釋放和環氧合酶2(COX-2)介導的前列腺素D-2(PGD-2)和前列腺素F-2α(PgF-2α)的產生[21]。IL1B(白介素1β)為促炎性因子,也是公認的中性粒細胞增多的誘因,可能導致明顯的中性粒細胞肺部炎癥。Kim等[22]發現哮喘患者中性粒細胞增多、激素抵抗和疾病嚴重程度與NLRP3和IL-1β表達增加相關。病毒誘導的哮喘加重會引起Th1型中性粒細胞增多和Th2型炎癥,這也與白介素1β的分泌有關[23]。JUN編碼轉錄因子激活蛋白1(activator protein 1,AP-1),其家族成員包括c-Jun、JunB、JunD、Fra-1、Fra-2和c-Fos,是TGF-β信號通路的下游分子[24]。Patil等[25]發現AP-1可能是激素在哮喘等慢性炎癥性肺部疾病中作用的重要分子機制,并對肺部炎癥性疾病的治療有一定的幫助。已知嗜酸性粒細胞在哮喘中起著核心作用,Kankaanranta等[26]發現TNF-α可抑制嗜酸性粒細胞的凋亡,AP-1可增強腫瘤壞死因子-α的抗凋亡作用。PPARG編碼過氧化物酶體增殖物激活受體 γ(PPAR-γ),是一種參與多種細胞過程的配體激活轉錄因子,參與多種細胞過程,和氧化應激基因的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)與哮喘風險相關[27]。呼吸道上皮細胞(airway epithelial cells,AECs)對進入呼吸系統的空氣中的刺激物進行炎癥反應,Lakshmi等[28]發現,PPARG直接與在黏蛋白5AC中發現的PPAR反應元件結合并抑制基因表達。同樣,PPARG調節原代人支氣管上皮細胞中的黏蛋白和炎癥因子,因此AEC-PPARg有作為治療哮喘藥物靶點的潛力。由上可知,這些關鍵靶點可作為“川貝母-人參”治療支氣管哮喘的重要指標。

圖3 藥物活性成分靶點與疾病靶點韋恩圖

圓代表靶點,顏色越深,圓越大表示與其他靶點互作關系越強

2.2.3 “核心藥物-成分-靶點-疾病”網絡構建結果

將核心中藥各活性成分及獲取的核心靶點,導入 WPS Excel 表格中建立相互對應關系,運用 Cytoscape 3.9.1 軟件構建“核心藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖,如圖5所示。圖5中共有226 個節點及807 條邊,其中包括28個藥物活性成分,167個靶點和30條P排名前列的信號通路。并用CytoNCA 插件計算出DC值,對該網絡進行拓撲分析。通過構建“核心藥物-成分-靶點-疾病”網絡,根據度值排列,結果顯示排名前5的成分為“beta-sitosterol”“kaempferol”“Stigmasterol”“suchilactone”“Fumarine”。

2.2.4 GO、KEGG富集分析

將70個核心靶點導入到DAVID數據庫進行GO和KEGG富集分析,選擇選擇“Homo sapiens”,以P<0.05 為篩選條件,得到GO條目共385條,將P由小到大進行排列,分別對BP、CC、MF的前10進行可視化分析,如圖6所示。由GO功能分析可知,其中BP有277條,主要參與對脂多糖、藥物、有機環狀化合物、異種刺激的反應,并與一氧化氮生物合成正調節、凋亡過程正調節等生物學過程;CC有42條,主要細胞溶膠、突觸前膜、大分子組分復合膜、膜筏、核質等細胞組分;MF有66條,主要與酶結合蛋白、同源二聚化活性、RNA聚合酶II-轉錄因子活性、配體激活的序列特異性DNA結合等分子功能。KEGG通路富集分析可知條目共89條,對排名前10 的通路進行可視化分析,如圖7所示。發現主要參與的通路包括脂質和動脈粥樣硬化、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、弓形蟲病、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、癌癥通路、腫瘤壞死因子信號通路、乙型肝炎、化學致癌-受體激活、IL-17信號通路等,說明篩選出的70個靶點蛋白可能通過這些通路發揮藥理活性,改善疾病病理變化。這也符合中藥通過多途徑、多靶點發揮治療作用的機制[29]。

選用每個模塊P值最小的前10個條目,其值越大,顏色越偏向紅色,反之則偏向藍色;條帶的長短表示富集數

此氣泡圖中其值越大,顏色越偏向紅色,反之則偏向綠色;點的大小表示富集數

2.3 活性成分與關鍵靶點的分子對接

利用Autodock Vina 1.1.2對2.2.2節獲取的Hub前五靶點和與2.2.3節獲取的排名前5的活性成分進行對接,結果見表 6。利用 PyMOL 軟件對靶點蛋白與成分對接的最佳構象進行可視化分析,直觀展示其構象關系,結果見圖8。分子對接結合能小于-5.0 kcal/mol則表明結合活性較強,且結合能越小,可知高頻活性藥物中Fumarine與BA疾病靶點的PTGS2最為緊密。

3 結論

肺系疾病是一種常見和多發疾病,包括肺臟主氣、司呼吸、宣肺肅降等功能異常引發的肺臟疾病,如咳嗽、喘證、哮病、肺癰、肺痿及相關疾病、如感受外邪類引發的感冒、風溫、秋燥、肺風、勞風等和鼻咽類疾病鼻鼽、鼻淵、喉喑、喉痹等[30]。川貝母在止咳祛痰、平喘、抗菌和抗腫瘤等方面具有較好的療效,其鎮靜、缺氧狀態下增強人體耐力的作用,對于痰多咳嗽的哮喘病人有益,其消炎抗菌作用能夠有效的改善呼吸道感染[31]。

通過數據挖掘技術分析可知,川貝母常與苦、甘、辛和微寒的中藥材配伍,在符合肺脾同治[32]的中醫理念基礎上,用于治療不同病癥的肺系疾病,如《退思集類方歌注》一書中記載的紫菀湯,其藥物組成為甘草、桔梗、紫菀、川貝母、杏仁;紫菀降氣、貝母潤肺、杏仁消痰、合甘、桔散風泄熱。經關聯規則和聚類分析得到含川貝母的核心藥對、藥組組合,為臨床肺系疾病的診療與新藥研究提供了理論支撐,開拓新處方思路,同時為后續劑量關系的研究奠定基礎。

利用網絡藥理學預測核心藥對治療支氣管哮喘的核心靶點和信號通路可知,“AKT1”“PTGS2”“IL1B”“JUN”“PPARG”均可作為治療支氣管哮喘的關鍵靶點,尤其Fumarine 對PTGS2結合緊密,為未來研究支氣管哮喘發作所涉及的信號通路及因子變化提供理論基礎,也為進一步開展臨床及基礎研究,即與分子生物學、代謝組學等學科的融合起到指導作用。