內皮細胞在心肌重構中的作用研究進展

劉方圓 唐其柱

慢性心力衰竭(以下簡稱心衰)是對特定的應激源(如持續壓力負荷或心肌梗死)的反應所引起心臟結構和功能發生異常變化的一組復雜的臨床綜合征。心肌重構被普遍認為是慢性心衰進展的關鍵過程,心臟最初通過增加大小和質量以使壁應力正?；⒃试S靜止時的正常心血管功能對額外的負荷或心臟損傷進行補償性反應[1]。隨著時間的推移,持續的壓力負荷或疾病會導致心室擴張、間質纖維化、收縮功能下降并最終發展為心衰[2]。Pinto等[3]研究發現,內皮細胞(endothelial cells, ECs)是非心肌細胞中數量最多的細胞類型,分布在血管的內表面,包括毛細血管、小動脈、動脈、靜脈和淋巴管,作為血液和血管壁之間的功能和結構屏障,具有調節血流和維持血管壁通透性的基本功能。內皮功能和冠狀動脈微循環的變化已被證明在心肌重構和心力衰竭的進展中發揮重要作用。Wan等[4]利用單細胞測序技術系統地探究了小鼠慢性心力衰竭非心肌細胞譜系的變化軌跡和內在調節反應,發現內皮細胞是導致晚期心力衰竭心臟進一步惡化或功能障礙的關鍵驅動因素。

心臟毛細血管密度降低、冠狀動脈血流儲備降低以及隨后的組織缺氧、細胞死亡和間質纖維化會導致收縮功能障礙和心力衰竭的發展。盡管有很多研究者對心肌重構的病理生理學方面進行研究,但尚未確定臨床有效的靶點。本文討論了心臟內皮細胞在心肌重構中的作用,著重關注內皮代謝、內皮間質轉化和內皮細胞衰老等內皮功能變化在心肌重構中的作用及研究進展,加深對心臟的復雜細胞環境在心肌重構中作用的理解,為找到治療心肌重構的策略提供可能性。

一、心臟內皮細胞

心臟是一個復雜的多細胞器官,由心肌細胞和非心肌細胞組成,包括心肌成纖維細胞、內皮細胞、平滑肌細胞、周細胞和免疫細胞等,它們密切合作和相互作用以維持正常的心臟功能和調節心臟修復[5,6]。近年來,單細胞RNA 測序技術(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)的發展幫助研究人員進一步準確地揭示了心臟的細胞組成和細胞表達網絡的異質性[7,8]。心臟中5 種最多的細胞類型分布是心肌細胞、內皮細胞、成纖維細胞、周細胞和巨噬細胞[7～9]。心臟的主要細胞組成如圖1。

圖1 心臟的細胞組成示意圖

雖然心肌細胞占心肌組織體積/質量的 70%～85%,其數量僅占心臟實際細胞數量的約1/3,非心肌細胞群的數量龐大,且對于正常的心臟穩態和功能同樣重要[10]。它們提供細胞外基質,介導細胞間通訊,并提供心肌細胞收縮和長期存活所需的血管供應。Pinto等[3]使用新的遺傳示蹤劑和增強的流式細胞術技術來分析人和小鼠的心臟,顯示內皮細胞是主要的非心肌細胞,數量占非肌細胞總數的 60%。在正常哺乳動物的心肌中,每個心肌細胞都被一個錯綜復雜的毛細血管網絡所包圍,并且緊挨著內皮細胞,每個心肌細胞與微血管內皮細胞的距離不超過 2～3μm[11]。內皮細胞表型在不同器官之間、同一器官內血管環的不同節段之間以及同一器官和血管類型的相鄰內皮細胞之間存在異質性。

二、scRNA-seq揭示內皮細胞在心肌重構中的作用

在組織細胞水平上,心臟重構是心肌中存在的所有細胞類型改變的結果,這些細胞類型也因心臟損傷、損傷、神經激素激活和壓力而相互密切相互作用。在心衰患者中發現心臟組織中的非心肌細胞會因衰竭而發生大規模的分子特征轉化,而成纖維細胞和內皮細胞是主要來源[4,8]。Wan等[4]研究發現,缺血引起的小鼠慢性心力衰竭增加了心臟成纖維細胞、內皮細胞及其亞群中特異性標志基因的數量。不僅是細胞數量上的變化,小鼠在心力衰竭階段基因表達水平變化也主要集中在這些細胞上[4,12]。Wang等[8]研究發現,與健康對照組比較,衰竭心臟中 EC3的保護因子分泌減少(從69.19%減少到27.56%),他們將配體與其相應的受體相關聯構建細胞-細胞相互作用圖,發現EC3與其他細胞類型的相互作用數量最多,突出了其在細胞串擾中的核心作用。

Ren等[13]用橫主動脈收縮模型(transverse aortic constriction, TAC)誘導的壓力過載后的不同階段來描述心肌肥厚過程中不同心臟細胞類型的時空相互作用,TAC早期觀察到EC亞型從正常心臟的炎性反應負調控(EC2)到心力衰竭的肌細胞發育(EC5和EC6)的功能轉變,導致心肌細胞肥厚。使用傳統的批量分析工具幾乎不可能在不同的細胞和組織類型之間分析和解釋旁分泌信號通路。用于分析 scRNA-seq 數據的信息學工具的開發為研究細胞間通訊和信號轉導提供了一個有前景的解決方案。內皮不僅控制血管內外物質的交換,還可通過分泌和釋放活性因子發揮調節作用[14]。Wan等[4]研究發現,在心力衰竭晚期,成纖維細胞與其他細胞的信號通訊明顯減弱,可能與在重構階段成纖維細胞整體過度老化有關,而內皮細胞與其他細胞的通訊加強。scRNA-seq 分離廣泛不同的細胞亞群,對細胞表型理解的突破為心血管基礎科學帶來了新的見解,有助于揭示與 HF 發病和進展有關的分子機制和開發新的改進療法。

三、內皮細胞代謝

心肌是具有高代謝需求的組織,需從密集的血管和毛細血管網絡接收血液和能量供應。與其他常駐細胞類型不同,心臟 ECs,特別是微血管 ECs,線粒體含量較低,葡萄糖是其用于產生能量的主要底物[15]。盡管可以立即獲得血液中的氧氣,ECs嚴重依賴糖酵解途徑(獲取超過 85% 的能量需求),而不是氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS),將葡萄糖轉化成乳酸產生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP),且利用糖酵解產生的ATP進行細胞增殖、遷移和血管新生,在此過程中產生的少量丙酮酸用于為 OXPHOS 提供燃料[16, 17]。當從靜止狀態轉變為增殖和遷移時,ECs 會增加糖酵解通量[17]。營養物質須通過毛細血管床運輸到心肌細胞,心臟 EC 表達高水平的脂肪酸轉運蛋白,以不斷地將脂肪酸輸送到心臟。

近年來的研究強調了 ECs 代謝在心肌重構和心衰中的重要性。He等[18]研究發現,在 SIRT3 缺陷型 ECs 中,內皮糖酵解代謝受損,導致心肌毛細血管稀疏、冠狀動脈血流儲備降低、血管周圍纖維化和舒張功能障礙。Gao等[19]研究發現,AngⅡ通過增強內皮細胞糖酵解誘導內皮-間質轉化(endothelial-mesenchymal transition, EndMT)從而影響血管周圍纖維化。此外,糖酵解代謝物之一乳酸還可以通過充當信號分子來調節血管生成。ECs 被認為是旁分泌信號的重要來源,作用于其環境中的細胞。最初被視為代謝廢物的乳酸(作為代謝燃料或誘導旁分泌效應的信號分子)因其在細胞間通訊中的作用而備受關注。在有氧條件下,細胞-細胞和細胞內的乳酸穿梭在心臟和其他組織之間實現能量底物的產生和分配以及細胞信號轉導的基本目的,乳酸脫氫酶的過表達誘導了肌成纖維細胞的形成[20]。

通過結合使用體外共培養系統和條件培養基實驗,Zhang等[21]研究表明,內皮細胞糖酵解代謝產生的乳酸經血管分泌啟動了乳酸穿梭,通過單羧酸轉運蛋白(monocarboxylate transporter 1,MCT1)被巨噬細胞攝取,激活巨噬細胞中 MCT1 依賴性氧化開關,促進巨噬細胞向具有促血管生成和促再生的M2 樣表型的極化。乳酸極化巨噬細胞還上調血管內皮生長因子的表達,從而形成進一步刺激血管生成的正反饋回路[21]。ECs不再是一個簡單的屏障,而是被組織損傷所激活,成為乳酸等代謝物的儲存庫。以含有大量乳酸的ECs為原料和燃料,與免疫細胞的乳酸轉運蛋白結合,促進細胞因子的釋放,增強免疫細胞對受損組織的修復作用。ECs 的主要能量來源來自葡萄糖酵解,而脂肪酸代謝和谷氨酰胺氧化通常被認為通過 OXPHOS 補充三羧酸循環。當糖酵解速率降低時,脂肪酸和氨基酸的氧化代謝提供的能量可能會增加,以支持 ECs 活性。抑制脂肪酸代謝和谷氨酰胺氧化導致ECs增殖減少。然而,這些ECs代謝途徑在心肌重構和心衰中的研究匱乏值得深入研究,ECs 和心臟環境中其他細胞之間的串擾中的作用和機制仍有待于充分探索,了解 EC 代謝的作用和潛在機制將促進調節血管生成相關疾病的新治療方法。

四、內皮間質轉化與心肌重構

盡管ECs的經典作用是確保血管內壁的正常功能,但越來越多的證據表明,ECs在器官發育、內穩態和組織修復中發揮著更直接和積極的作用。EndMT是一個復雜的生物學過程,在此過程中內皮細胞進行性和動態喪失其典型的鵝卵石形態和緊密連接,顯示典型的間充質細胞形態和功能,獲得增加的運動性和分泌 ECM 蛋白的能力[22, 23]。內皮細胞在EndMT過程中失去內皮細胞特異性蛋白的表達,如CD31/血小板-內皮細胞黏附分子、血管性血清學因子和血管內皮黏附蛋白,并開始間充質細胞特異性基因的表達和編碼蛋白的產生,包括α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin, α-SMA)、成纖維細胞特異性蛋白-1以及Ⅰ型和Ⅲ型膠原(COL-1、COL-3)等[23]。內皮間質轉化示意圖詳見圖2。

圖2 內皮間質轉化示意圖

單細胞測序發現心臟組織中的非心肌細胞會因衰竭而發生大規模的分子特征轉化,而內皮細胞是主要來源之一[4]。EndMT通常被認為與心肌重構中的心肌纖維化、傷口修復和炎癥有關[24]。心臟纖維化是晚期心力衰竭患者的共同特征,主要與舒張功能障礙和心臟僵硬度增加有關。心肌纖維化瘢痕的數量與心律失常和猝死的發生率增加密切相關[25]。Ricard等[26]誘導內皮特異性敲除Erk2小鼠在 5 周內死亡,影響心臟傳導系統的纖維化是這些小鼠普遍致死的原因。免疫染色和內皮命運圖譜顯示這些小鼠 TGF-β 信號轉導的強烈增加導致廣泛的EndMT,室間隔和左心室內廣泛存在心肌纖維化[26]。然而,內皮細胞對間充質細胞譜系的貢獻始終存在爭議。Tombor等[27]揭示了小鼠心肌梗死后經歷短暫間充質激活(transient mesenchymal activation, EndMA)而不是完整的EndMT,即部分EndMT。在小鼠心肌梗死后的第1周ECs 主要聚集在具有間充質基因的簇中,獲得了短暫的間充質激活狀態,在14天后恢復到基線水平。這些EndMA 細胞表達適度水平的間充質標記基因,且在體外是可逆的[27]。

Peisker等[28]將遺傳命運追蹤與共聚焦成像和單細胞 RNA 測序相結合,對小鼠心力衰竭期間細胞類型特異性轉錄組的變化進行分析,沒有觀察到TAC后內皮細胞中內皮間質轉化或瞬時間充質激活基因組的富集。但這些爭議并不能完全排除ECs 對心臟纖維化的貢獻,首先來源于內皮細胞間充質細胞擾亂了內皮細胞的屏障功能,增強了內皮細胞與心肌細胞的相互作用,有助于心肌成纖維細胞的積累和心肌細胞的丟失,從而促進心肌纖維化。其次在心臟纖維化過程中,其他未被檢測的基因,如骨膜素等,仍有可能被瞬時激活。另外,經歷 EndMA/EndMT的內皮細胞可能分泌細胞外基質和相關炎癥蛋白,這會影響傷口愈合反應,從而可能間接促成纖維化。

五、內皮細胞衰老

內皮功能隨年齡的增長而逐漸衰退,在細胞水平上,氧化和炎癥應激的持續積累導致內皮細胞衰老,導致遺傳和表觀遺傳改變,表現為形態改變、表型改變、DNA損傷、細胞周期阻滯和代謝途徑紊亂?；酌氀苊芏冉档秃脱芊磻越档褪顾ダ辖M織易缺血,對血管生成刺激的反應性降低和內皮細胞增殖能力降低限制了組織的恢復和修復。衰老與內皮細胞的血管生成功能相關,在衰老的內皮細胞中,增殖減少可能會限制形成新血管結構的能力,血管生成和血管消退過程之間的動態平衡對于維持心臟和其他器官(包括大腦)中的微血管網絡至關重要。衰老還通過改變控制增殖、黏附、遷移、細胞凋亡、生長因子和細胞因子的合成和釋放、平滑肌募集和血管穩定的關鍵細胞信號轉導途徑,損害內在的內皮血管生成過程。

在老化的內皮細胞中,內皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS) 的豐度或活性降低,內源性 NOS 抑制劑水平升高,L-精氨酸供應減少,由 NOX 氧化酶產生的活性氧水平增加,一氧化氮(nitric oxide, NO)的生物利用度降低,不僅會導致血管舒張功能障礙,還將損害血管生成和血管退化過程之間的動態平衡,并促進微血管稀疏。在代謝方面,衰老降低內皮細胞的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)水平,衰老細胞(如衰老 ECs)分泌的衰老相關分泌表型因子可以增加體外非衰老細胞中CD38 的表達,CD38 是一種消耗 NAD+ 的酶,通過其外酶活性降低組織 NAD+ 的水平[29,30]。有研究表明,NAD+中間體——煙酰胺單核苷酸治療可逆轉年齡相關的內皮功能障礙,并改善內皮血管生成過程。谷氨酰胺分解是衰老內皮細胞在體內和體外存活所必需的,而抑制谷氨酰胺分解可以消除衰老內皮細胞并改善與年齡相關的器官功能障礙。

近年來研究發現,抑制谷氨酰胺酶1(glutaminase 1, GLS1,谷氨酰胺分解的第一個酶和限速酶)改善ANG Ⅱ誘導的小鼠心肌重構中的心肌肥厚和纖維化[31]。煙酰胺核苷 (nicotinamide riboside, NR) 是研究最多的 NAD+ 前體之一,可用于恢復包括內皮在內的多種組織中隨年齡增長而穩步下降的 NAD+ 水平,已在心衰的幾個臨床前模型中顯示出有希望的治療前景[31]。Zhang等[32]研究發現,使用NR治療提高了人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)線粒體未折疊蛋白反應的水平,降低了HUVECs中成纖維細胞特異性標志物波形蛋白和α-SMA 的表達,并增強了EC 特異性標志物 CD31的表達,由 TGF-β1 誘導的HUVECs內皮間質轉化得以抑制。衰老內皮細胞和周圍心臟細胞群之間存在串擾,衰老的內皮細胞顯示內皮素-1 (endothelin-1, ET-1,血管收縮劑之一) 產生增加, ET-1 分泌導致衰老的心臟成纖維細胞中膠原蛋白合成增加,導致膠原蛋白和纖連蛋白積累,這是與年齡相關的心臟重構的特征。衰老內皮細胞群可能是藥物去除衰老細胞或抑制衰老表型來治療與年齡相關的血管功能障礙的潛在靶點。

六、展 望

綜上所述,心臟中的內皮細胞通過代謝,內皮間質轉化以及內皮衰老在調節心肌纖維化、心肌肥厚以及血管生成發揮了重要作用。心臟內皮細胞對來自鄰近細胞的血流動力學和旁分泌信號做出反應,通過刺激心肌細胞的生長和收縮力或在肌成纖維細胞中產生細胞外基質蛋白,甚至會改變其表型并轉分化為產生細胞外基質的細胞,積極參與心臟重構過程,在從適應性心臟肥大到心力衰竭的轉變中起著核心作用。然而,潛在的治療策略目前僅限于實驗、臨床前階段,尚未進入臨床。未來可利用scRNA-seq 進行組學分析進一步探究心臟不同位置內皮細胞和衰老內皮細胞在心肌重構和心衰中的作用,尋找可能的心衰的治療靶點。

在臨床干預之前創建患者特異性細胞圖譜,基于scRNA-seq 的細胞數量、基因表達譜和細胞異質性評估將補充現有的診斷測試,并告知醫生確定最有效、個性化的治療選擇。通過直接或間接干擾激活EndMT的信號通路抑制內皮間充質轉化和心肌纖維化在眾多臨床前實驗被研究。除此之外還應關注到部分EndMT是動態可逆的,間質細胞還通過間充質-內皮細胞轉化 (mesenchymal-endothelial transition, MEndT) 獲得內皮樣功能,參與受損心臟區域的血管生成,修復受損血管,逆轉心肌纖維化,詳見圖2。未來可深入探索控制 EC 可塑性的調節機制,尋找新的可能的靶點特異性調節和促進MEndT,以MEndT替代EndMT響應環境壓力,提高MEndT衍生細胞的功能成熟度,識別MEndT衍生細胞的表型特性和特征,尋找MEndT衍生細胞如何被精確調控并轉化為特定功能性內皮細胞群的新機制,為治療心肌纖維化和心臟肥大提供新的策略。總之,內皮細胞在心肌重構和心衰進展中發揮著重要作用,繼續研究靶向內皮細胞的治療策略有助于將相關療法推廣至臨床應用中。