SCFAs調節線粒體自噬改善高糖下胰島β細胞損傷的研究

王思瑤 陸春暉 張 潔 靳 瑾

糖尿病現已成為全球日益嚴重的公共衛生問題,嚴重威脅著人類健康。作為以高血糖為主要特征的慢性進行性代謝疾病,糖尿病主要由遺傳和環境因素共同導致,而胰島β細胞功能異常是導致糖尿病發生、發展的關鍵因素[1,2]。機體內血糖長期處于升高狀態會誘導氧化應激、炎癥等反應發生,加速胰島β細胞凋亡,進而使其功能受損,引起糖尿病及相關并發癥的發生[3]。目前,尋找改善高糖環境作用下胰島β細胞功能損傷的藥物或分子靶標,對于開發糖尿病的新型有效治療方案來說意義重大。

短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)主要由膳食纖維和未消化碳水化合物發酵過程中的腸道微生物群所產生,也是腸道上皮細胞能量供應的重要來源,其主要包括乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉[4]。據報道,SCFAs能夠促進腸黏膜上皮細胞增殖,改善腸道屏障的完整性,防止微生物易位,并進一步抑制炎性反應。然而,腸道菌群失調和產生SCFAs的細菌減少常見于各種代謝疾病中,包括糖尿病和肥胖癥[5,6]。在臨床研究和動物建模研究中,增加膳食纖維攝入量或給予SCFAs,能夠對炎癥性腸病、過敏性氣道疾病、1型糖尿病和2型糖尿病發揮保護作用,并抑制促炎性細胞因子的分泌和活性氧的產生,這表明SCFAs在治療慢性炎癥或代謝疾病方面具有廣闊的治療潛力,但其確切機制仍不明晰[7～9]。本研究旨在探討乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉3種SCFAs對高糖環境下所誘發胰島β細胞功能損傷的影響及其可能的作用機制。

材料與方法

1.主要材料與試劑:大鼠胰島素瘤INS-1細胞購自美國ATCC公司,胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司,乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉購自美國Sigma公司,青-鏈霉素雙抗、RPMI1640完全培養基及胰蛋白酶購自美國Gibco公司,CCK-8試劑盒購自上海漢恒生物工程有限公司,Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司,Hoechst 33258染液和DCFH-DA熒光探針購自北京百奧萊博科技有限公司,胰島素含量檢測試劑盒購自上海超研生物科技有限公司,環氧樹脂購自美國Bio-Rad公司,RIPA裂解液、BCA測定試劑盒及ECL購自上海碧云天生物技術有限公司,兔抗LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、PINK1及Parkin單克隆抗體購自英國Abcam公司,兔抗GAPDH多克隆抗體與辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國 Santa Cruz公司。其他試劑均為國產分析純。

2.方法

(1)細胞培養與分組處理:INS-1細胞置于37℃、5%CO2培養箱中培養,添加RPMI1640完全培養基(含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗),每24h更換1次培養液,待其長滿瓶壁70%后,0.25%胰酶消化,常規傳代培養。將對數生長期的細胞接種于96孔培養板,分組后進行對應處理,具體如下:①對照組:使用5mmol/L葡萄糖處理細胞;②模型組:使用33mmol/L葡萄糖處理細胞,建立高糖誘導損傷;③乙酸鈉(sodium acetate,NaA)組:預先以100μmol/L NaA處理細胞24h,然后高糖誘導損傷;④丙酸鈉(sodium propionate,NaP)組:預先以100μmol/L NaP處理細胞24h,然后高糖誘導損傷;⑤丁酸鈉(sodium butyrate,NaB)組:預先以100μmol/L NaB處理細胞24h,然后高糖誘導損傷。處理結束后,收集各組細胞進行后續實驗。

(2)CCK-8法檢測細胞增殖活性:INS-1細胞接種到96孔細胞培養板中,處理后24h,每孔中加入10μl CCK-8溶液,孵育培養2h,通過酶標儀檢測每孔450nm處吸光度(absorbance,A)值,計算細胞增殖率,細胞增殖率(%)=實驗組A450/對照組A450×100%。

(3)流式細胞術檢測細胞凋亡水平:收集5組INS-1細胞,常規消化后離心,PBS清洗細胞,加入適量1×binding buffer重懸細胞,調整密度為1×106個/毫升,吸取100μl細胞懸液移入流式檢測管,再依次加入5μl Annexin V-FITC和10μl碘化丙錠,震蕩混勻,室溫孵育10min,立即通過流式細胞儀上機檢測各組細胞凋亡情況。

(4)Hoechst 33258染色觀察細胞凋亡形態:收集5組INS-1細胞,PBS清洗后,加入5μg/ml Hoechst 33258工作染液,置于37℃培養箱內避光孵育30min,PBS洗滌細胞并重懸,取適量細胞混懸液制片,在熒光顯微鏡下觀察并拍攝圖片,結果中細胞核呈亮藍色熒光。

(5)放射免疫法測定細胞釋放胰島素的含量:將5組INS-1細胞分別以2×105個/孔接種于48孔細胞培養板中,置于37℃、5%CO2培養箱培養過夜后,以4000r/min(離心半徑10cm)離心30min,吸取上清液,放射免疫法檢測不同處理組細胞釋放胰島素的含量,具體步驟按照試劑盒說明書進行。

(6)DCFH-DA熒光探針測定細胞ROS水平:將5組INS-1細胞分別以1×104個/孔接種于96孔細胞培養板中,添加含有10μmol/L DCFH-DA 的無血清培養基培養細胞,置于37℃培養箱內孵育30min,在熒光顯微鏡下觀察并拍攝圖片,通過酶標儀檢測激發波長488nm、發射波長525nm處每孔細胞的熒光強度。

(7)透射電子顯微鏡觀察線粒體超微結構及自噬泡:收集5組INS-1細胞,PBS清洗,用預冷的2.5%戊二醛固定液固定過夜,再用1%四氧化鋨中固定,分級乙醇溶液中脫水后,環氧樹脂包埋。切片后,樣品用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色,在透射電子顯微鏡觀察各組細胞線粒體形態及線粒體自噬情況,拍攝圖片。

(8)Western blot法檢測線粒體自噬相關蛋白表達水平:添加RIPA裂解緩沖液分別提取5組INS-1細胞蛋白,BCA法蛋白定量,于-70℃冰箱中保存備用。在蛋白樣品中加入等體積樣品緩沖液,煮沸變性,每泳道按30μg上樣,通過10%SDS-PAGE電泳后,電轉至PVDF 膜上。常溫下以5%脫脂奶粉封閉并震蕩1h,在膜上加入LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、PINK1及Parkin的單克隆抗體,共置于4℃冰箱孵育過夜,用辣根過氧化物酶標記的對應二抗,室溫孵育1h,ECL顯影并定影,以GAPDH作為內參蛋白,Image J軟件測定各蛋白條帶灰度值,計算各蛋白相對表達量。

結 果

1.各組INS-1細胞增殖率比較:與對照組比較,模型組細胞增殖率顯著降低(P<0.05);而NaA組、NaP組及NaB組細胞增殖率均顯著高于模型組細胞增殖率(P<0.05),詳見圖1。

圖1 各組INS-1細胞增殖率比較與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

2.各組INS-1細胞凋亡水平比較:與對照組比較,模型組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與模型組比較,NaA組、NaP組及NaB組的細胞凋亡率均顯著降低(P<0.05),詳見圖2。

圖2 各組INS-1細胞凋亡率比較與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

通過Hoechst 33258染色觀察到對照組INS-1細胞形態結構完整,外圍輪廓清晰,細胞大小較為一致;模型組的部分細胞內出現濃縮、碎裂的藍色凋亡體,說明細胞發生損傷與凋亡;相較于模型組,NaA組、NaP組以及NaB組細胞內濃縮與碎裂現象有所改善,未見明顯的藍色凋亡體,詳見圖3。

圖3 各組INS-1細胞凋亡形態觀察(Hoechst 33258染色,×200)A.對照組;B.模型組;C.NaA組;D.NaP組;E.NaB組。箭頭所指為藍色凋亡體

3.各組INS-1細胞胰島素釋放含量比較:與對照組比較,模型組細胞的胰島素釋放量顯著降低(P<0.05);而相較于模型組,NaA組、NaP組及NaB組的細胞胰島素釋放水平均顯著增加(P<0.05),詳見圖4。

4.各組INS-1細胞活性氧水平比較:與對照組比較,模型組細胞熒光強度顯著升高(P<0.05),說明細胞內ROS水平增加;與模型組比較,NaA組、NaP組及NaB組的各組細胞熒光強度均顯著降低(P<0.05),說明細胞內ROS水平下降,詳見圖5。

圖5 各組INS-1細胞ROS水平測定(DCFH-DA染色,×100)A.對照組;B.模型組;C.NaA組;D.NaP組;E.NaB組。與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

5.各組INS-1細胞線粒體超微結構觀察結果:TEM下觀察到對照組線粒體形態結構完整,嵴清晰可見;模型組線粒體結構受損,有明顯的空泡形成、嵴破壞和自噬體吞噬等現象;NaA組、NaP組及NaB組線粒體受損現象均較模型組明顯減輕,自噬體吞噬減少,詳見圖6。

圖6 各組INS-1細胞線粒體超微結構觀察(TEM,×10000)A.對照組;B.模型組;C.NaA組;D.NaP組;E.NaB組。箭頭所指為線粒體吞噬體,M表示線粒體

6.各組INS-1細胞線粒體自噬相關蛋白表達比較:與對照組比較,模型組細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,PINK1與Parkin蛋白相對表達量顯著上調,而p62蛋白相對表達量顯著下調(P<0.05);與模型組比較,NaA組、NaP組及NaB組的細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低,PINK1與Parkin蛋白相對表達量顯著下調,同時,p62蛋白相對表達量顯著上調(P<0.05),詳見圖7。

圖7 各組INS-1細胞線粒體自噬相關蛋白表達比較與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

討 論

糖尿病的特征在于各種代謝異常,主要包括糖代謝和脂代謝以及其他內分泌激素的代謝紊亂,從而引起高血糖、胰島素分泌不足、胰島素功能障礙等[2]。在過去的幾十年中,我國糖尿病及其并發癥的發生率一直在穩步上升[10]。血糖穩態由胰島控制,胰島主要由α細胞、β細胞、δ細胞和PP細胞組成。其中,胰島α細胞通過分泌胰高血糖素促進肝葡萄糖合成來提高血糖水平;胰島δ細胞分泌生長抑素,通過旁分泌信號途徑下調胰島α細胞和胰島β細胞釋放的激素;胰島PP細胞分泌的胰多肽對于胰島素分泌具有再調節作用;胰島β細胞則通過刺激脂肪、肌肉、肝臟和腸細胞中的血糖攝取來釋放胰島素,從而達到降低血糖水平的效果[11]。

研究表明,胰島β細胞受損是糖尿病發生的主要病理性特征,糖尿病患者體內血糖一直處于較高水平,這將直接誘導胰島β細胞損傷,增加體內胰島素抵抗,進而導致胰島素釋放降低,血糖水平進一步上升,產生惡性循環,這種持續性作用會導致胰島β細胞衰竭,其特征是胰島β細胞功能障礙和數量明顯減少[12,13]。目前,控制血糖的治療策略主要集中在口服藥物和胰島素注射兩個方面,口服藥物如磺脲類藥物,可以通過不同的信號通路促進內源性胰島素分泌,但容易引起嚴重的低血糖癥;外源性胰島素注射,尤其是針對新發糖尿病的短期強化胰島素治療,可使胰島β細胞功能得到恢復[14]。雖然這些干預措施可以控制血糖或暫時改善胰島素分泌,但由2型糖尿病引起的并發癥的發生率并沒有顯著降低,主要原因可能是缺乏內在的對胰島β細胞的直接保護方式。

大量研究指出,SCFAs在糖尿病的病理生理學中起關鍵作用。例如,與健康對照組比較,1型糖尿病患者產生SCFAs的細菌數量明顯減少,促進SCFAs合成的基因也減少,這與微生物群紊亂有關[15]?；加?型糖尿病的患者產生SCFAs的微生物群和SCFAs豐度降低,這是由于腸道微生物群改變、腸道屏障受損以及血漿脂多糖水平升高所致[16]。在小鼠模型中,使用SCFAs進行干預可以緩解1型糖尿病,這是通過降低自身免疫T細胞計數、抑制B淋巴細胞增殖以及擴大結腸、脾臟和全身淋巴結中的FoxP3+Treg細胞實現的[17]。此外,已有研究表明,SCFAs在糖尿病患者中的有利作用主要體現在降低血糖水平、改善胰島素抵抗、減輕炎癥和增強胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)的分泌。SCFAs可以保護胰島β細胞免受游離脂肪酸和其他一些細胞因子造成的損害,如采用SCFAs中的丙酸鈉預處理可顯著減少棕櫚酸鹽和炎性細胞因子誘導的胰島β細胞死亡,增強葡萄糖刺激的胰島素分泌和維持胰島β細胞質量[18]。本研究結果同樣顯示,經過乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉預處理,明顯降低了高糖環境誘導的INS-1細胞凋亡,并增加了胰島素釋放水平,由此進一步說明了SCFAs可能在糖尿病中發揮胰島保護作用。

胰島β細胞長期處于高糖環境下會增加細胞內活性氧產生,而ROS的過量累積會導致胰島β細胞凋亡[19]。因此,清除胰島β細胞內過量的ROS并增強抗氧化能力是保護細胞免受高糖刺激受損的可行方法。本研究結果顯示,在高糖環境刺激下INS-1細胞內ROS水平顯著增加,而經過3種SCFAs乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉預處理的INS-1細胞內ROS水平均顯著下降,該結果說明SCFAs能夠抑制高糖環境刺激下INS-1細胞內ROS水平的增高,從而抑制氧化應激反應,對胰島β細胞發揮保護作用。

線粒體自噬參與調節糖尿病中胰島β細胞的生理功能,通過自噬可以去除由內質網應激引起的錯誤折疊蛋白質或受損線粒體,并抑制氧化應激反應,由此說明該途徑是控制線粒體質量的重要途徑之一[20]。然而,由長期氧化應激引起的線粒體自噬也是多種疾病的共同特征,例如糖尿病、動脈粥樣硬化、神經退行性疾病及脂質紊亂[21～23]。在糖尿病中,過度的線粒體自噬會損害胰島β細胞并減少其胰島素分泌,此外,還有助于線粒體內ROS的產生、NLRP3依賴性促炎反應的激活和脂毒性的加劇[24]。但關于高糖環境下線粒體自噬的潛在機制尚未完全闡明,探索基于胰島β細胞自噬保護作用是控制糖尿病的有效方式。PINK1/Parkin途徑是啟動線粒體自噬的重要信號通路,當線粒體膜電位減小時,PINK1可以結合到線粒體中,將Parkin募集到線粒體外膜并啟動線粒體自噬[25]。

本研究檢測結果顯示,經高糖環境誘導的INS-1細胞線粒體明顯受損,內有自噬體吞噬現象,自噬相關蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,p62蛋白相對表達量下調,PINK1與Parkin蛋白相對表達量均上調;而經乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉預處理的INS-1細胞線粒體受損程度減小,自噬相關蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低,p62蛋白相對表達量上調,PINK1與Parkin蛋白相對表達量均下調,該結果提示SCFAs能夠通過調節線粒體自噬而改善高糖環境刺激下的胰島β細胞功能損傷。

綜上所述,本研究結果表明,3種SCFAs乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉能夠保護高糖環境刺激下的INS-1細胞功能損傷,其可能的作用機制是通過抑制ROS產生及線粒體自噬實現的。該研究進一步明確了高糖環境下胰島β細胞功能受損引起糖尿病發病的機制。但關于SCFAs保護高糖環境下損傷胰島β細胞確切的分子機制尚不清楚,需要后續進行深入探究。