去氫木香內酯通過PI3K/Akt通路對喉癌細胞增殖、轉移和侵襲的影響

徐 蓮 陸 雪 李 堂 戴潤芝 江 洋

喉癌是頭頸部發生率較高的一種惡性腫瘤,目前主要通過手術、放化療和生物治療等方式進行治療,5年生存率有所提高,但是高復發率和轉移率仍是預后面臨的一個重要難題,因此深入研究喉癌發生、發展的具體機制具有重要意義[1]。去氫木香內酯是木香揮發油中含量較高的倍半萜內酯,也是木香具有藥理學作用的主要生物活性成分,具有廣泛的抗腫瘤活性。去氫木香內酯可抑制肝癌細胞增殖、誘導癌細胞凋亡[2]。此外,去氫木香內酯可使細胞內大量產生活性氧,誘導胃癌細胞自噬性死亡和凋亡[3]。但是,去氫木香內酯在喉癌中的作用需要進一步研究。

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號通路是細胞內重要的信號轉導通路,研究發現,PI3K/Akt信號通路在喉癌中異常激活,小檗堿通過抑制該信號通路可抑制喉癌細胞生長和轉移[4]。長鏈非編碼RNA SSTR5-AS1通過抑制PI3K/Akt信號通路活化抑制喉癌細胞增殖、遷移和侵襲[5]。但是去氫木香內酯是否能通過調節PI3K/Akt信號通路發揮抗喉癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用尚未可知,因此本研究探討去氫木香內酯對喉癌惡性生物學行為的影響及其具體機制,為降低喉癌發生率和提高喉癌患者生存率提供新的研究思路和靶點。

材料與方法

1.細胞系:人喉癌Hep-2細胞購自美國ATCC公司。

2.試劑和儀器:去氫木香內酯(純度≥98%,批號:A0302,成都曼思特生物科技有限公司);MTT試劑盒(批號:C0009,上海碧云天生物科技有限公司);Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(批號:G003-1-2,南京建成生物工程研究所);DMEM培養基以及胰蛋白酶(批號:C11995500BT,25200-056,美國Gibco公司);p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、Sox-2、CD44、CD133和Nanog抗體(批號:ab278545、ab302958、ab38449、ab8805、ab92494、ab243894、ab109250,英國Abcam公司);CytoFLEX流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司);Varioskan LUX多功能酶標儀(美國Bio-Rad公司);DYCZ-24F雙垂直電泳儀(北京六一儀器廠)。

3.細胞培養與轉染:將Hep-2細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中,置于37℃、5% CO2以及飽和濕度的培養箱中,每天更換1次培養基,每2天進行消化傳代,取傳至第4代的細胞用于實驗。

4.MTT法檢測細胞存活率:第4代對數生長期細胞經胰蛋白酶消化,離心后,調整為5×103個/毫升的細胞密度,將100μl細胞懸液加入96孔板,重新置于恒溫培養箱中培養,細胞貼壁生長后,將細胞分為0、10、20和30μmol/L組,各孔分別加入含對應濃度的去氫木香內酯的培養基進行培養,分別在去氫木香內酯處理24、48和72h后,每孔加入MTT溶液10μl,重新培養4h,置于酶標儀下測量450nm波長處吸光度(A)值,細胞增殖抑制率(%)=(對照孔A值-藥物孔A值)/對照孔A值×100%。

5.流式細胞儀檢測細胞凋亡率:對數生長期細胞調整為5×103個/毫升的細胞密度,將100μl細胞懸液加入96孔板,細胞貼壁生長后,將細胞分為0、10、20和30μmol/L組,各孔分別加入含對應濃度的去氫木香內酯的培養基進行培養,24h后,胰蛋白酶消化收集細胞,加入磷酸鹽緩沖液400μl,輕輕吹打,將細胞制成懸液,在向細胞懸液中加入Annexin-V 5μl,充分混勻,4℃避光孵育15min,再加入碘化丙啶 10μl,充分混勻,避光孵育5min,流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

6.Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力:細胞侵襲能力檢測:無血清培養基將基質膠稀釋,并平鋪于上室,將經不同濃度去氫木香內酯培養24h的細胞制成1×106個/毫升的細胞懸液,取200μl置于Transwell小室上室,在下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培養基,之后將小室放置于培養箱中培養24h,濕棉簽輕輕擦去未穿膜細胞,甲醛固定,0.1%結晶紫染色,顯微鏡下計數細胞數并拍照。細胞遷移能力檢測:除Transwell小室上室不鋪基質膠外,其余操作同細胞侵襲能力檢測。

7.蛋白印跡法檢測細胞中蛋白相對表達量:收集經不同濃度去氫木香內酯處理后的Hep-2細胞,預冷PBS清洗2次,裂解液冰上裂解30min,4℃ 12000r/min(離心半徑8cm)離心10min,收集上清液,BCA法測定蛋白濃度,100℃煮沸。每孔上樣20μl,設置電泳儀參數為120V 2h,蛋白分離后,將蛋白濕轉至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h,將PVDF膜裁開進行抗體孵育(4℃孵育過夜),二抗室溫孵育,TBST洗膜,ECL顯影液在成像系統中曝光,Image J分析條帶灰度值,目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH灰度值。

結 果

1.MTT法檢測:與0μmol/L組比較,10、20和30μmol/L去氫木香內酯分別作用24、48和72h后,細胞增殖抑制率均顯著升高,且具有濃度和時間依賴性(P<0.05,表1)。

表1 各組細胞增殖抑制率比較

2.流式細胞儀檢測侵襲能力:與0μmol/L組(2.97%±0.85%)比較,10、20和30μmol/L去氫木香內酯組(9.01%±0.62%、16.79%±1.35%、28.65%±1.31%)細胞凋亡率均顯著升高,且有濃度依賴性(P<0.05,圖1)。

圖1 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況A.0μmol/L組;B.10μmol/L組; C.20μmol/L組; D.30μmol/L組

3.Transwell實驗檢測侵襲能力:與0μmol/L組(446.89±30.20個)比較,10、20和30μmol/L去氫木香內酯組(364.82±33.12、259.51±33.06、161.56±29.25個)侵襲細胞數減少,且具有濃度依賴性(P<0.05,圖2)。

4.Transwell實驗檢測遷移能力:與0μmol/L組(491.31±41.89個)比較,10、20和30μmol/L去氫木香內酯組(432.66±45.36、358.02±35.92、158.05±24.23個)遷移細胞數減少,且有濃度依賴性(P<0.05,圖3)。

5.蛋白印跡法檢測:與0μmol/L組比較,10、20和30μmol/L去氫木香內酯組p-PI3K、p-Akt、Sox-2、CD44、CD133和Nanog蛋白相對表達量均降低(P<0.05),且有濃度依賴性。各組間PI3K和Akt蛋白相對表達量比較,差異無統計學意義(P>0.05,表2,圖4)。

圖4 不同濃度去氫木香內酯對細胞中蛋白表達的影響A.0μmol/L組;B.10μmol/L組;C.20μmol/L組;D.30μmol/L組

表2 各組細胞中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、Sox-2、CD44、CD133和Nanog蛋白相對表達量比較

討 論

近年來,喉癌的發生率呈逐年上升趨勢,但是,對于喉癌發生的具體機制尚不明確,普遍認為其與吸煙、飲酒、接觸有害粉塵以及乳頭狀瘤病毒感染等多種因素有關,其發生和惡化進程是個復雜的轉化過程,涉及多條信號通路的調控作用[6]。去氫木香內酯是從云木香的干燥根莖中提取的一種含有α-亞甲基-γ-內酯環結構的倍半萜類化合物,該結構能與含有巰基的酶及其功能性蛋白酶發生反應,進而干擾細胞的代謝過程,是具有多種藥理學活性的化合物[7]。研究發現,去氫木香內酯通過抑制胃泌素瘤細胞增殖、阻滯細胞周期以及造成DNA損傷和線粒體膜電位降低,從而發揮抗胃泌素瘤作用[8]。去氫木香內酯通過抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡,發揮抗乳頭瘤作用[9]。馬強等[10]研究發現,去氫木香內酯可抑制乳腺癌SK-BR-3細胞增殖,誘導其發生凋亡。由此可見去氫木香內酯具有廣泛的抗腫瘤活性,因此,本研究旨在探討去氫木香內酯是否具有抗喉癌作用及其具體機制。

腫瘤形成是一個十分復雜的生物學過程,其生長取決于細胞增殖和凋亡之間的平衡,抗腫瘤藥物主要通過抑制腫瘤細胞增殖以及促進細胞凋亡發揮抗腫瘤作用。本實驗結果顯示,不同濃度去氫木香內酯均可抑制喉癌Hep-2細胞增殖,誘導癌細胞凋亡,且具有濃度依賴性。此結果說明,去氫木香內酯具有抗喉癌作用。癌細胞發生遷移和侵襲是腫瘤患者預后不良的重要原因,也是導致患者5年生存率降低的主要因素,因此阻斷細胞發生遷移和侵襲對提高患者5年生存率至關重要。癌細胞發生遷移和侵襲是一個多步驟、多因素參與的復雜過程,研究發現,喉癌細胞具有較強的轉移和侵襲能力[11]。本實驗結果顯示,不同濃度去氫木香內酯可降低Hep-2細胞遷移和侵襲數量,說明去氫木香內酯具有抑制喉癌遷移和侵襲的作用。

研究發現,PI3K/Akt信號通路活化在喉癌細胞轉移和侵襲過程中發揮重要作用,miR-509-3p過表達通過抑制PI3K/Akt信號通路可抑制喉癌細胞增殖、遷移和侵襲[12]。長鏈非編碼RNA SSTR5-AS1通過降低p-PI3K和p-Akt表達抑制喉癌細胞遷移和侵襲能力[13]。Li等[14]研究發現去氫木香內酯通過抑制PI3K和Akt活化從而抑制重組HPV-18 HaCaT細胞生長,誘導細胞凋亡,可能是一種新的治療尖銳濕疣的潛在藥物。

本研究中蛋白印跡法結果顯示,不同濃度去氫木香內酯均可降低p-PI3K和p-Akt蛋白相對表達量,說明去氫木香內酯可抑制喉癌細胞中PI3K/Akt信號通路活化。癌癥干細胞(cancer stem cells,CSCs)能夠實現自我更新,而且產生異質性腫瘤,CSCs具有無限增殖能力,可以維持腫瘤細胞群的活力[13]。研究表明,長鏈非編碼RNA PINT通過調控miR-425-5p/PTCH1軸抑制喉癌細胞干細胞特性從而抑制喉癌發生[14]。Sox-2、CD44、CD133和Nanog是干細胞特異性標志物[15]。因此本研究通過蛋白印跡法檢測干細胞特異性標志物蛋白表達情況,結果顯示,不同濃度去氫木香內酯可降低Sox-2、CD44、CD133和Nanog蛋白相對表達量,且具有濃度依賴性,說明去氫木香內酯可抑制喉癌干細胞特性,抑制癌細胞增殖。

綜上所述,去氫木香內酯可抑制喉癌細胞增殖、遷移和侵襲,同時可抑制喉癌干細胞特性,其可能是通過阻礙PI3K/Akt信號通路活化發揮作用,為臨床治療喉癌提供理論依據。