I2PP2A蛋白調(diào)控PP2A/Akt信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響

傅 品 黃 娟 夏嘉輝 張 文 馮 瓊

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma, NB)是兒科中最常見(jiàn)的顱外實(shí)體惡性腫瘤,主要起源于原始神經(jīng)嵴細(xì)胞并沿著交感神經(jīng)鏈方向分化[1]。神經(jīng)母細(xì)胞瘤具有高度異質(zhì)性,在臨床上表現(xiàn)為自發(fā)消退或在強(qiáng)化多模式治療后仍出現(xiàn)疾病進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[2]。雖然近年來(lái)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和臨床研究取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步,但在需要治療的病例中,高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后仍然很差,5年生存率約為40%,且發(fā)生轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)后的生存時(shí)間為12個(gè)月左右[3～5]。神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及多個(gè)基因調(diào)控異常,蛋白磷酸酶2A抑制劑-2(protein phosphatase2A inhibitor-2,I2PP2A)是由SET基因編碼的多功能癌蛋白,其C末端結(jié)構(gòu)域與PP2Ac相互作用抑制PP2A磷酸酶活性被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的最常見(jiàn)機(jī)制。PP2A酶活性下降可影響Akt、Erk等下游分子的去磷酸化,激活A(yù)kt、Erk等信號(hào)通路,最終促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生、凋亡抑制、化療耐藥增強(qiáng)及預(yù)后不良等[6～8]。此外,I2PP2A能與其他蛋白質(zhì)相互作用,影響和調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞死亡[9～11]。研究發(fā)現(xiàn),I2PP2A在多種類型的癌癥中高表達(dá)[12]。I2PP2A蛋白在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色,而I2PP2A在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的作用及其機(jī)制尚不明確。因此,本研究旨在 RNA 干擾條件下,探討I2PP2A蛋白是否在神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖凋亡中發(fā)揮作用,并初步探討其可能機(jī)制,旨在為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療提供新方法。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料:人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系提供。含I2PP2A的shRNA干擾質(zhì)粒(siI2PP2A-shRNA)和無(wú)義對(duì)照質(zhì)粒(siC-shRNA)由上海生工生物工程有限公司構(gòu)建合成。抗體Akt(#9272)、p-Akt(#4060)、CyclinD1(#55506)、Bcl-2(#3498)、Bax(#2774)、cleaved-PARP(#9548)、p-Erk(#4370)、Erk(#4695)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔二抗、鼠二抗(#7074、#7076)購(gòu)自美國(guó)CST公司;抗體DM1A(α-tubulin)(T9026)和岡田酸(okadaic acid,OA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;抗體I2PP2A(sc-133138)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司。超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(編號(hào)P0018S)及CCK-8試劑盒(編號(hào)C0038)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。非放射性Serine/Threonine Phosphatase Assay System試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司;Annexin V Alexa Fluor?488 &PI cell Apoptosis Kit、轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100μg/ml)的DMEM 培養(yǎng)基中,置于5% CO2,37℃培養(yǎng)箱內(nèi)穩(wěn)定培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度為70%～80%時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染,通過(guò)轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,6h后更換成完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.Western blot法:收集轉(zhuǎn)染后的兩組SH-SY5Y細(xì)胞,采用RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白后用BCA法測(cè)定其濃度,根據(jù)等質(zhì)量上樣原則進(jìn)行SDS-PAGE電泳,電泳完畢后轉(zhuǎn)至PVDF膜,用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1h,加入一抗4℃冰箱孵育過(guò)夜,次日,滴加HRP標(biāo)記的二抗繼續(xù)孵育1h,ECL化學(xué)發(fā)光顯色,Gel-Pro Analyzer軟件分析目的蛋白灰度。

4.PP2A活性檢測(cè):細(xì)胞裂解完畢后,使用非放射性Serine/Threonine Phosphatase Assay System試劑盒測(cè)定 PP2A活性。該測(cè)定基于鉬酸鹽孔雀綠-磷酸鹽復(fù)合物的吸光度來(lái)確定反應(yīng)中產(chǎn)生的游離磷酸鹽量。按照說(shuō)明書(shū)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,最終通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得磷酸酶活性。

5.CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SH-SY5Y細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板,并分別將siC對(duì)照質(zhì)粒及siI2PP2A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中,按照CCK-8檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)分別在24、48、72h時(shí)每孔加入10μl CCK-8溶液及90μl完全培養(yǎng)基,置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1h后檢測(cè)450nm波長(zhǎng)處吸光度(A)值。

6.細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn):將已轉(zhuǎn)染后的各組SH-SY5Y細(xì)胞加入含10% FBS的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,接種至6孔板(每孔約500個(gè)細(xì)胞),并將其放置于含37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2周,期間每隔3天半量換液并觀察細(xì)胞狀態(tài);克隆形成后棄去培養(yǎng)基加入PBS洗滌1次,采用4%多聚甲醛固定15min,0.1%結(jié)晶紫染色15min。PBS洗滌多次,晾干,對(duì)每孔計(jì)數(shù)并拍照。

7.細(xì)胞周期檢測(cè):將SH-SY5Y細(xì)胞以1×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種至24孔板中,待轉(zhuǎn)染培養(yǎng)結(jié)束后,收集細(xì)胞并用預(yù)冷的PBS洗滌,離心棄上清,留少許液體制成細(xì)胞懸液,緩慢加入冰冷無(wú)水乙醇,置于4℃冰箱固定過(guò)夜。第2天取出,800×g離心5min,棄去上清,PBS洗滌并向細(xì)胞懸浮液中加入RNase A,37℃水浴15min,加入碘化丙啶溶液,避光孵育1h后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)FL2熒光強(qiáng)度。

8.流式細(xì)胞凋亡檢測(cè):SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)結(jié)束后收集上層培養(yǎng)基并放置一旁,胰酶消化細(xì)胞,將同組消化后的細(xì)胞懸液和收集的上層細(xì)胞培養(yǎng)基合并,1000×g離心5min棄上清,PBS洗滌后離心并收集細(xì)胞。根據(jù)Annexin V Alexa Fluor?488 &PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞染色并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

結(jié) 果

1.shRNA轉(zhuǎn)染效率檢測(cè): 將siC對(duì)照質(zhì)粒與siI2PP2A干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細(xì)胞,48h后采用Western blot法檢測(cè)I2PP2A蛋白相對(duì)含量。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染靶向I2PP2A的shRNA干擾質(zhì)粒可顯著下調(diào)SH-SY5Y細(xì)胞中I2PP2A蛋白相對(duì)表達(dá)量(P<0.01,圖1)。

圖1 轉(zhuǎn)染I2PP2A siRNA下調(diào)SH-SY5Y細(xì)胞中I2PP2A蛋白表達(dá)

2.下調(diào)I2PP2A蛋白對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響:對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的CCK-8實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析,在培養(yǎng)24h后siC組細(xì)胞A值為0.45±0.06,siI2PP2A組為0.41±0.04,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);siC組細(xì)胞在培養(yǎng)48h后A值為0.62±0.05,siI2PP2A組為0.52±0.06,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.666,P=0.001);在培養(yǎng)72h 后siC組細(xì)胞A值為1.02±0.09,siI2PP2A組為0.78±0.07,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=37.292,P<0.001)。此外,細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示,siC組的細(xì)胞克隆數(shù)為190.70±18.90個(gè),siI2PP2A組為121.30±12.22個(gè),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.335,P=0.006),以上數(shù)據(jù)提示,下調(diào)I2PP2A能抑制SH-SY5Y細(xì)胞的增殖(圖2)。

圖2 轉(zhuǎn)染I2PP2A siRNA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響A.siC與siI2PP2A組CCK-8檢測(cè)結(jié)果,與siC組同時(shí)間比較,*P<0.01,**P<0.001(n=8);B.siC組與siI2PP2A組細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)(n=3)

3.下調(diào)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)I2PP2A蛋白對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞周期的影響:細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)顯示,經(jīng)t檢驗(yàn),兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與siC組比較,siI2PP2A組在細(xì)胞分裂的G0/G1期比例增多,而在細(xì)胞分裂S期和G2/M期細(xì)胞比例降低(圖3)。以上提示下調(diào)I2PP2A可促使SH-SY5Y細(xì)胞周期停滯于G1期。

圖3 轉(zhuǎn)染I2PP2A siRNA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞周期的影響

4.下調(diào)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)I2PP2A蛋白對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響:流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,siC組SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡率為1.89%±1.09%,siI2PP2A組為15.18%±5.60%,經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.031,P=0.016),下調(diào)I2PP2A后SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率顯著增加(圖4),表明下調(diào)I2PP2A可誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。

圖4 轉(zhuǎn)染I2PP2A siRNA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

5.下調(diào)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)I2PP2A蛋白對(duì)細(xì)胞中CyclinD1、Bcl-2、Bax、cleaved-PARP蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響:兩組細(xì)胞中CyclinD1、Bcl-2、Bax、cleaved-PARP蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與siC組比較,siI2PP2A組CyclinD1和Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05),但可促進(jìn)Bax、cleaved-PRAP蛋白的表達(dá)(P<0.01,圖5)。

圖5 轉(zhuǎn)染I2PP2A siRNA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

6.下調(diào)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)I2PP2A蛋白可激活PP2A活性:siC組與siI2PP2A組PP2A活性相對(duì)活性分別為100%±12%、146%±15%,siI2PP2A組PP2A 活性較siC組顯著升高(t=-4.219,P=0.013,圖6A)。此外,下調(diào)I2PP2A蛋白能夠抑制PP2A下游磷酸化Akt蛋白(P<0.01),而Akt、p-Erk、Erk差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),表明Akt信號(hào)通路受阻(圖6B)。以上結(jié)果提示下調(diào)I2PP2A蛋白可激活PP2A磷酸酶活性,抑制Akt信號(hào)通路。

圖6 轉(zhuǎn)染I2PP2A siRNA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞PP2A酶活及其下游相關(guān)蛋白表達(dá)的影響A.下調(diào)I2PP2A后兩組細(xì)胞PP2A酶活檢測(cè)結(jié)果;B.兩組細(xì)胞PP2A下游相關(guān)蛋白含量檢測(cè)及定量分析

7.重激活PP2A活性可逆轉(zhuǎn)下調(diào)I2PP2A蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖及凋亡抑制:下調(diào)I2PP2A蛋白誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡及增殖抑制是否由 PP2A磷酸酶活性改變引起,筆者給予PP2A磷酸酶抑制劑OA處理siI2PP2A組細(xì)胞48h,終濃度0.5nmol/L。結(jié)果顯示,SH-SY5Y細(xì)胞在給藥OA培養(yǎng)后siC組A值為0.58±0.03,siI2PP2A組為0.46±0.03,siI2PP2A+OA組為0.52±0.03,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.842,P=0.007)。此外,給予OA顯著逆轉(zhuǎn)siI2PP2A組的p-Akt、CyclinD1、Bcl-2、Bax、cleaved-PARP蛋白水平(P<0.05,圖7)。

圖7 重激活PP2A活性是下調(diào)I2PP2A蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)鍵步驟A.給予OA處理后3組CCK-8檢測(cè)結(jié)果;B.給予OA處理后Western blot法檢測(cè)3組細(xì)胞中相關(guān)蛋白的影響;C.3組細(xì)胞相關(guān)蛋白含量定量分析

討 論

隨著醫(yī)療水平的提高和放化療技術(shù)的成熟,神經(jīng)母細(xì)胞瘤的綜合治療已取得重大進(jìn)步,但由于患者預(yù)后差別大,治療效果仍然不佳。I2PP2A作為人體組織中普遍表達(dá)的一種多功能癌蛋白,在多種惡性腫瘤細(xì)胞高表達(dá),其在調(diào)節(jié)不同類型癌細(xì)胞生物學(xué)特性方面具有重要作用[12]。有研究發(fā)現(xiàn),下調(diào)I2PP2A蛋白或使用靶向I2PP2A拮抗劑FTY720和OP449能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生成、遷移、侵襲和克服耐藥性[7, 13～15]。本研究采用RNA干擾技術(shù)特異性沉默I2PP2A,抑制PP2A活性調(diào)控其下游蛋白Akt及凋亡相關(guān)蛋白的合成,最終抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡,為臨床治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤提供一種新的治療靶點(diǎn)。

細(xì)胞異常增殖和凋亡途徑的紊亂與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),I2PP2A可提高多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖能力并抑制其細(xì)胞凋亡[16]。有研究報(bào)道,基因敲除I2PP2A蛋白可顯著降低肺癌A549和H460細(xì)胞的增殖能力和集落形成[17]。與上述研究一致,本研究在體外沉默I2PP2A后,SH-SY5Y細(xì)胞增殖率顯著下降、細(xì)胞克隆形成數(shù)目減少、CyclinD1蛋白表達(dá)降低、G0/G1期細(xì)胞比例升高、S期細(xì)胞和G2/M期細(xì)胞比例下降。提示I2PP2A參與了神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖調(diào)控,下調(diào)I2PP2A可抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖并使細(xì)胞周期停滯于G1期。

凋亡是一種程序性死亡,該過(guò)程受多種凋亡基因相互調(diào)控,Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子之一,其家族內(nèi)促凋亡成員(如Bax和Bak)和抗凋亡成員(如Bcl-2和Bcl-XL)共同調(diào)控細(xì)胞凋亡并維持內(nèi)在平衡[18]。PARP是體內(nèi)caspase-3 的主要剪切靶標(biāo)之一, PARP 剪切可促進(jìn)細(xì)胞崩解并可以作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)志[19]。本研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)I2PP2A可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Bax和PARP剪切體表達(dá)增高、Bcl-2表達(dá)水平降低,引起凋亡明顯增加,表明I2PP2A通過(guò)調(diào)控Bax和PARP促進(jìn)細(xì)胞凋亡。由此可見(jiàn),I2PP2A蛋白變化是神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)和凋亡抑制的原因之一。

以上結(jié)果證明,下調(diào)I2PP2A能夠改變神經(jīng)母細(xì)胞瘤相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)特征,但引起上述變化的具體分子機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn),I2PP2A可通過(guò)抑制PP2A活性介導(dǎo)細(xì)胞增殖,使用I2PP2A拮抗劑FTY720可恢復(fù)PP2A活性并降低體外細(xì)胞增殖能力和侵襲潛力,抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)[17]。本研究顯示,在SH-SY5Y細(xì)胞中沉默I2PP2A可增加PP2A活性。PP2A 是一種廣泛表達(dá)的絲氨酸蘇氨酸磷酸酶,通過(guò)調(diào)控多種關(guān)鍵細(xì)胞分子(包括Akt、Erk和c-Myc等)發(fā)揮作用,其中Akt可磷酸化細(xì)胞內(nèi)蛋白并參與細(xì)胞增殖、存活、遷移和代謝過(guò)程[20～22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示下調(diào)I2PP2A可促進(jìn)Akt的去磷酸化,強(qiáng)烈表明PP2A/Akt信號(hào)通路參與了I2PP2A介導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程。進(jìn)一步使用 PP2A 抑制劑OA可拮抗下調(diào)I2PP2A對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖抑制和凋亡增加的作用。以上結(jié)果證實(shí)PP2A的活化在I2PP2A介導(dǎo)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖凋亡通路中起關(guān)鍵作用。

綜上所述,本研究結(jié)果證實(shí),下調(diào)I2PP2A可通過(guò)介導(dǎo) PP2A/Akt信號(hào)通路抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡,提示I2PP2A可能是神經(jīng)母細(xì)胞瘤治療的潛在靶點(diǎn),為臨床治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。