通過PI3K/Akt信號通路調控p21對放射性肺損傷的防護作用*

楊 依,陳 凡,馮瑞興,郝彥惠,高 悅

(1.青海大學醫學部,西寧 810001;2.青海大學附屬醫院,西寧 810001)

放射性肺損傷(Radiation-induced lung injury,RILI)是胸部放射治療最常見并發癥[1],它的防治在國內外相關領域是一道學術難題。因此,能夠降低RILI的發生,對提高患者的生存率和生活質量具有積極意義。

多項研究表明,PI3K/Akt信號通路是RILI發生的關鍵通路并參與RILI的發生,當接收到輻射刺激時,PI3K活化,激活Akt,活化的Akt可激活下游多種信號分子[2]。通過阻斷該信號通路,抑制PI3K、Akt磷酸化,抑制該通路中各分子的表達,可減輕肺損傷[3,4]。p21蛋白屬于PI3K家族,是PI3K/Akt信號通路下游的效應蛋白[5]。LY294002是細胞實驗及動物實驗中廣泛使用的PI3K/Akt信號通路抑制劑,能夠抑制PI3K、Akt的磷酸化,從而阻礙通路的激活[6]。在高原環境下,有關通過PI3K/Akt信號通路調控p21對RILI的防護作用未見報道。

本研究基于小鼠RILI模型,在抑制PI3K/Akt信號通路的基礎上,探討通過PI3K/Akt信號通路調控p21對RILI的防護作用,為臨床防治RILI提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

56只C57BL/6小鼠,SPF級,6～8周齡,體質量18～20 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號為SCXK(京)2021-0006。在青海大學高原醫學中心實驗室動物房飼養,溫度為20℃,濕度為50%～60%,所有動物實驗程序遵守國家動物實驗管理的政策法規和實驗動物倫理福利原則。

1.1.2 主要試劑及儀器

醫用電子直線加速器(23EX,美國Varian醫療系統公司),PI3K抑制劑LY294002(HY-10108,美國MCE公司),PI3K抗體(YM3504,美國Immunoway公司),p-Akt抗體(YP0006,美國Immunoway公司),p21抗體(Bs-55160R,北京博奧森有限公司),高速冷凍離心機(MiCrofuge 22R,美國Beckman公司),石蠟包埋機(Arcadia H,德國Leica公司),石蠟切片機(RM2245,德國Leica公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及給藥方法

小鼠適應性喂養7 d,將56只小鼠均分為7組:對照組、10Gy組、10Gy+LY294002組、15Gy組、15Gy+LY294002組、20Gy組、20Gy+LY294002組。根據文獻[7]所示方法使用LY294002。

1.2.2 照射方法

將麻醉小鼠固定于特制固定板上,采用醫用電子直線加速器照射胸部(6MV-X線,單次胸部劑量分別為10、15、20 Gy,劑量率為300 cGy/min,源皮距為100 cm)。小鼠頭部和腹部用多葉光柵遮擋。

1.2.3 HE染色方法

將肺組織從4%多聚甲醛中取出行常規操作。

1.2.4 IHC方法

取肺組織以常規方法制作切片。染色的陽性細胞呈棕黃色或深褐色。

1.2.5 RT-PCR方法

采用Trizol法從小鼠肺組織中提取總RNA,反轉錄成cDNA,根據SYBR PCR試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR實驗。實時熒光定量PCR實驗采用兩步法,第一步:在95℃條件下預變性30 s,循環1次;第二步:在95℃條件下預變性10 s,在60℃條件下預變性30 s,循環40次。p21上游引物為5′-CAGCTCAGGACTGGAAGG-3′,下游引物為5′-TCCGGAGGGTCTCGTAAGAT-3′,GAPDH上游引物為5′-TGATGGGTGTGAACGAG-3′,下游引物為5′-GGTGTCAGGTACGGTAGTGA-3′,以GAPDH為內參,用2-△△Ct法計算p21mRNA相對表達水平。

1.2.6 Western Blot方法

取冷凍的肺組織樣本提取組織蛋白,經轉膜封閉后依序加入一抗(p21、PI3K、p-Akt)和二抗后曝光顯影。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 小鼠體質量變化情況

對照組體質量增加明顯;與對照組比,各單純照射組小鼠體質量隨劑量增加明顯減輕,P<0.05;與15Gy、20Gy組比,15Gy+LY294002、20Gy+LY294002組體質量增加,P<0.05。(表1)

表1 各組小鼠的體質量

2.2 小鼠肺組織病理變化情況

HE染色切片顯示,對照組小鼠肺組織結構清晰,肺泡形態正常,肺泡壁薄;10Gy組可見局部少量炎細胞浸潤及異型細胞,肺泡間隔增寬不明顯;10Gy+LY294002組可見炎細胞浸潤減少(較10Gy組);15Gy組可見炎細胞浸潤(明顯),少量細胞水腫,部分細胞核深染,還發現異型細胞(明顯);20Gy組可見肺泡上皮細胞增生、肺泡間隔增寬、細胞核深染、炎細胞浸潤;15Gy+LY294002、20Gy+LY294002組小鼠的RILI較15Gy、20Gy組減輕。 (圖1)

圖1 各組小鼠肺組織HE染色圖(HE,×100)

2.3 小鼠肺組織p21陽性細胞表達情況

IHC染色切片顯示,p21在正常肺組織中幾乎無表達;與對照組相比,各單純照射組小鼠肺組織p21陽性細胞隨劑量增加而逐漸增多;與單純照射組相比,同劑量照射+LY294002組小鼠肺組織p21陽性細胞隨劑量增加而相對減少。(圖2)

圖2 各組小鼠肺組織IHC染色圖(×200)

2.4 小鼠肺組織p21吸光度和p21mRNA表達的情況

與對照組相比,各單純照射組小鼠肺組織p21吸光度值較高、p21mRNA相對表達量較高;與單純照射組相比,同劑量照射+LY294002組小鼠肺組織p21吸光度值較低、p21mRNA相對表達量較低。(表2)

表2 各組小鼠肺組織p21吸光度和p21mRNA表達量

2.5 小鼠肺組織蛋白表達情況

與對照組相比,各單純照射組小鼠肺組織p21、PI3K、p-Akt相對蛋白表達量均為高表達,P<0.05;與單純照射組相比,同劑量照射+LY294002組小鼠肺組織p21相對蛋白表達量均為低表達,P<0.05;同劑量照射+LY294002組小鼠肺組織PI3K相對蛋白表達量均為低表達,P<0.05;同劑量照射+LY294002組小鼠肺組織p-Akt相對蛋白表達量均為低表達,P<0.05。(表3,圖3)

圖3 各組小鼠肺組織相對蛋白表達量的電泳圖

表3 各組小鼠肺組織p21、PI3K、p-Akt相對蛋白表達量

3 討論

早期發現,PI3K/Akt信號通路抑制導致許多惡性腫瘤被異常激活[8,9]。PI3K/Akt信號通路在肺癌細胞增殖中起重要作用[10]。研究發現,PI3K/Akt信號通路與相關大鼠RILI機制有關(PI3K、Akt磷酸化,介導損傷的肺細胞凋亡)[11],與本研究結果一致。Tsoyi[12]等研究發現,通過調節PI3K/Akt信號通路,可抑制成纖維細胞活化并減輕輻射誘導的肺纖維化。肺組織炎癥因子可激活PI3K/Akt信號通路,可促進肺泡上皮細胞轉化為肺間質細胞,表明PI3K/Akt信號通路參與放射性肺纖維化的形成[13]。而且PI3K抑制劑還可以克服肺癌放射治療中的耐藥性,因此準確識別受益于PI3K治療的患者群體是研究的重點[14]。研究發現,由LY294002干預的衰老細胞中的PI3K、p-Akt、p21表達水平明顯降低。PI3K-Akt是上調p21的激酶,參與細胞內多種信號的激活[15],與本研究結果一致。單純照射組p21蛋白表達水平升高,而加入PI3K/Akt信號通路抑制劑后表達降低,小鼠放射損傷程度減輕。本實驗采用小鼠全肺單次照射10、15、20 Gy的X射線,建立RILI模型[16-18]。單純照射組隨著劑量增加,小鼠肺組織出現不同程度的損傷,而同劑量照射+LY294002組小鼠的肺組織損傷相對較輕。表明抑制PI3K/Akt信號通路下游p21蛋白表達水平能夠有效預防或減輕RILI的發生。

綜上所述,通過抑制PI3K/Akt信號通路可降低小鼠肺組織p21表達,對小鼠RILI具有防護作用。