多房棘球蚴囊液對沉默DDIT4后小鼠肝細胞生物學功能的影響※

尹鳳嬌,徐 凱,陳佳昕,仁增卓嘎,乜 茹,冶賡搏,龐明泉,樊海寧,曹得萍,王海久*,王志鑫

(1.青海大學附屬醫院 肝膽胰外科,西寧 810001;2.青海省包蟲病研究重點實驗室,西寧 810001;3.桂林醫學院基礎醫學院 基礎醫學教研室,桂林 541199)

DNA損傷誘導轉錄因子4(DNA damage-inducible transcript 4,DDIT4)是一種與代謝、免疫等相關的蛋白,在損傷等應激條件下高表達。在前列腺癌、卵巢癌等眾多惡性腫瘤的表達中有顯著性差異,且在抗腫瘤治療中起著“保護傘”作用[1-3]。肝多房棘球蚴病病灶邊界不清楚,囊液持續外滲,刺激周圍肝細胞,導致正常肝細胞損傷。徐凱[4]等研究發現,正常小鼠肝細胞經多房棘球蚴囊液(HCF)干預后,細胞活性明顯受到抑制,且DDIT4在凋亡、自噬相關蛋白中高表達。本研究觀測HCF對沉默DDIT4后小鼠肝細胞生物學功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞系

正常小鼠肝細胞株(AML-12)購自中國科學院上海生命科學研究所,保存于青海大學附屬醫院中心實驗室。

1.1.2 小鼠

BALB/c小鼠購自南京市江寧區青龍山動物繁殖場,動物合格證號:No.201930977。

1.1.3 主要試劑和儀器

RIPA裂解液、0.25%胰蛋白酶消化液(不含EDTA)、嘌呤霉素(puromycin)均購自北京索萊寶科技有限公司,DMEM/F12培養基購自武漢普諾賽生命科技有限公司,CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司,DDIT4一抗、Beclin-1一抗購自美國Abcam公司,Caspase-3一抗、LC3A/B一抗購自美國Cell Signaling Technology公司,β-actin抗體、HRP山羊抗兔二抗購自武漢愛博泰克生物科技有限公司,RNA Simple總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒購自天根生化科技有限公司,DDIT4引物、18S引物購自華大基因公司,LV-Ddit4-RNAi、陰性對照病毒購自吉凱基因公司。生物倒置顯微鏡系統購自日本OLYMPUS公司,熒光化學發光成像系統購自美國GE公司,酶標儀購自德國Tecan公司,電泳儀購自BIO RAD公司,PCR基因擴增儀購自美國ABI公司,普通高速離心機購自Sigma公司,Cytation5細胞成像微孔板檢測系統購自美國BioTek公司,實時熒光PCR儀購自Roche公司,透射電子顯微鏡購自HITACHI公司。

1.2 方法

1.2.1 囊液收集及處理

將造模小鼠采用頸椎脫臼法處死,以無菌方式打開腹腔并小心分離多房棘球蚴囊泡(用PBS反復多次清洗),并將囊泡放至20 mL無菌注射器內,以擠壓方式分離囊液并離心(3200 r/min,7 min),用濾器(0.22 μm)過濾離心囊液后分裝,并存于-80℃冰箱備用。

1.2.2 慢病毒LV-Ddit4-RNAi轉染

小鼠肝細胞按規定密度(4×104個/mL)接種于六孔板中。24 h后當細胞覆蓋率為20%～30%時進行慢病毒轉染。根據《慢病毒使用操作手冊》要求,每組細胞分別加入LV-Ddit4-RNAi 1、LV-Ddit4-RNAi 2、LV-Ddit4-RNAi 3和LV-Ddit4-NC病毒,以及相應的轉染增強液置培養箱(37℃,5% CO2)培養。用嘌呤霉素篩選穩定細胞株,并進行RT-qPCR及Western Blot鑒定,檢測各組DDIT4基因mRNA和蛋白表達量,并確定合適的慢病毒進行轉染。

1.2.3 小鼠肝細胞DDIT4蛋白的表達量檢測

分別收集經HCF作用后的LV-Ddit4-RNAi 1、LV-Ddit4-RNAi 2、LV-Ddit4-RNAi 3和LV-Ddit4-NC細胞,細胞用含有PMSF蛋白酶抑制劑的Ripa緩沖液做冰上裂解(30 min)、離心(4℃,12 000 r/min,10 min)后取上清液后用5×蛋白上樣緩沖液稀釋并水浴(95℃,10 min),通過BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白樣品濃度。取30 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳。結束后轉移至0.2 μm PVDF膜上,用5%脫脂奶粉封閉(室溫,1 h)。將膜與DDIT4(1:1000)、β-actin(1:1500)一抗一同孵育(4 ℃,過夜)。第二天對稀釋(1:5 000)的用HRP標記的二抗進行孵育(室溫,1 h)。使用增強型ECL化學發光系統進行印記檢測(以β-actin為內參)。使用Image J軟件對蛋白條帶進行灰度分析。

1.2.4 小鼠肝細胞DDIT4的表達量檢測

直接提取細胞總RNA,將適量的RNA逆轉錄成cDNA,采用RT-qPCR法檢測4組DDIT4的mRNA表達量,篩選慢病毒。將4個樣品用DDIT4基因和內參基因引物擴增,見表1。每個反應重復3次。采用20 μL體系建立擴增體系。采用兩步法PCR反應程序進行實驗。PCR結果分析由ABI Q5 PCR儀完成。

表1 DDIT4、18S引物序列

1.2.5 HCF對沉默DDIT4后小鼠肝細胞形態學影響

收集轉染后的小鼠肝細胞接種于6孔板(3×105個/孔),24 h后更換培養基并加入濃度為0.0、0.4、0.8 mg/mL的HCF,分別與細胞培養48 h。

1.2.6 HCF對沉默后小鼠肝細胞活性的影響

收集轉染后的小鼠肝細胞接種于96孔板(1×104個/孔),24 h后更換培養基并加入濃度為0.0、0.4、0.8 mg/mL的HCF,處理48 h后,每孔加入CCK-8試劑孵育。

1.2.7 凋亡自噬相關蛋白水平檢測

同1.2.3所示方法。

1.2.8 細胞內超微結構觀察

收集轉染后的小鼠肝細胞,在培養皿(35 mm)接種細胞(1×106個/皿),24 h后更換培養基,并加入不同濃度的HCF培養48 h。從EP管中收獲培養48 h的細胞,用PBS洗滌2次;用2.5%戊二醛固定(過夜)后以1%鋨酸固定(避光,室溫)2 h,再用不同濃度梯度(30%、50%、70%、80%、95%、100%)乙醇進行脫水,然后浸透、包埋、聚合、切片、拍照,在電鏡下觀察細胞內超微結構。

1.2.9 統計學處理

2 結果

2.1 慢病毒轉染效率

2.1.1 細胞慢病毒轉染情況

使用Image J軟件檢測熒光細胞所占全視野細胞的百分比達80%以上,可用于后續實驗。如圖1。

A為明場鏡下圖(×100);B為同一視野熒光圖(×100),綠色熒光表明慢病毒已成功轉染細胞

2.1.2 經HCF作用后的慢病毒轉染小鼠肝細胞的DDIT4蛋白表達量

經HCF作用后慢病毒轉染小鼠肝細胞的DDIT4蛋白表達水平檢測結果顯示,LV-Ddit4-RNAi 1、LV-Ddit4-RNAi 2、LV-Ddit4-RNAi 3組分別與LV-Ddit4-NC組比較,前三組DDIT4蛋白含量顯著下降,LV-Ddit4-RNAi 3組尤為顯著(P<0.01),見圖2、表2。因此最終選用LV-Ddit4-RNAi 3組細胞做后續實驗。

圖2 小鼠肝細胞DDIT4蛋白表達圖

表2 小鼠肝細胞DDIT4蛋白表達結果

2.1.3 經HCF作用后慢病毒轉染小鼠肝細胞的DDIT4基因表達量

經HCF作用后慢病毒轉染小鼠肝細胞的DDIT4基因表達水平檢測結果顯示,LV-Ddit4-RNAi 1、LV-Ddit4-RNAi 2、LV-Ddit4-RNAi 3組分別與LV-Ddit4-NC組比較,前三組DDIT4基因表達水平均顯著下降,LV-Ddit4-RNAi 3組尤為顯著(P<0.01),見表3。

表3 小鼠肝細胞DDIT4的表達結果

2.2 HCF對沉默后AML-12細胞形態的影響

與HCF共培養48 h后,con組LV-Ddit4-NC和LV-Ddit4-RNAi組細胞形態多呈橢圓形或者圓形,細胞生長密度正常,貼壁良好,連接成島狀;而LV-Ddit4-RNAi組分別經過0.4、0.8 mg/mL HCF處理后細胞數及狀態明顯好于LV-Ddit4-NC 0.4、0.8 mg/mL組,多數細胞形態較正常,且貼壁狀態良好,可見少部分細胞漂浮于培養基中,見圖3。

圖3 48 h后各組細胞形態鏡下圖(×100)

2.3 AML-12細胞活力

與LV-Ddit4-NC 0.4、0.8 mg/mL組細胞比較,LV-Ddit4-RNAi 0.4、0.8 mg/mL組細胞OD值明顯上升,增殖率也隨之增加(P<0.01);與HCF共培養48 h后,沉默DDIT4組細胞形態接近正常AML-12細胞形態,多呈橢圓形或者圓形,且細胞生長密度較LV-Ddit4-NC組明顯為高。見表4。

表4 HCF對各組AML-12細胞活力的影響

2.4 凋亡自噬相關蛋白水平

與LV-Ddit4-NC con組比較,LV-Ddit4-NC 0.4、0.8mg/mL HCF組Beclin-1、LC3-II、Caspase-3蛋白表達顯著升高(P<0.01);與LV-Ddit4-RNAi con組比較,LV-Ddit4-RNAi 0.4 mg/mL HCF組的Beclin-1表達具有統計學意義(P<0.05),LV-Ddit4-RNAi 0.8 mg/mL HCF組的Beclin-1表達具有統計學意義(P<0.01);與LV-Ddit4-RNAi con組相比,LV-Ddit4-RNAi 0.8 mg/mL HCF組的Caspase-3表達具有統計學意義(P<0.05);與LV-Ddit4-NC 0.4、0.8 mg/mL HCF組比較,LV-Ddit4-RNAi 0.4、0.8 mg/mL HCF組的LC3-II表達具有統計學意義 (P<0.05),Beclin-1、Caspase-3蛋白表達具有統計學意義(P<0.01)。與LV-Ddit4-RNAi con組比較,LV-Ddit4-RNAi 0.4、0.8 mg/mL組的LC3-II表達無統計學意義(P>0.05)。見圖4、表5。

圖4 Caspase-3、Beclin-1、LC3蛋白水平表達圖

表5 凋亡自噬相關蛋白水平

2.5 細胞內超微結構

LV-Ddit-4-NC和LV-Ddit4-RNAi組的透射電鏡圖顯示,胞質未見明顯損傷,線粒體基質較均勻,粗面內質網未見明顯擴張,自噬水平低,見圖5a-d;LV-Ddit4-RNAi 0.4、0.8 mg/mL組細胞損傷較輕,胞質內存在較多脂滴,自噬數量增多,見圖5e-h;LV-Ddit4-NC 0.4、0.8 mg/mL組細胞損傷最嚴重,粗面內質網嚴重擴張,胞質內存在大量脂滴,可見大量自噬結構,見圖5i-l。

圖5 各組AML-12細胞超微結構圖

3 討論

DDIT4是位于染色體10(10q22.1)上,由232個氨基酸組成的一種蛋白質。有研究表明,DDIT4能發揮廣泛的細胞及生物學功能[5-6]。DNA損傷轉錄誘導在多種細胞中出現,正常情況下DDIT4均呈低表達,且半衰期短,很難被檢測出來[7]。

在寄生蟲感染中,由于蟲體寄生誘發了宿主細胞的內質網應激反應并啟動未折疊蛋白反應。多種應激條件下,自噬水平會顯著上升[8]。

Hou等[9]研究發現,沉默DDIT4后可減輕LPS誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡現象。Su等[10]研究得出,降低DDIT4表達水平可減輕蛛網膜下腔出血患者腦脊液中代謝產物所引起的原代皮層神經元凋亡。DDIT4也可密切參與對細胞自噬的調控作用[11-12]。本課題組前期研究發現[4],HCF對正常小鼠肝細胞有損傷作用。國內外眾多研究發現,DDIT4可能與細胞凋亡、細胞自噬密切相關,故本研究篩選LV-Ddit4-RNAi 3做相關實驗。

本研究觀測HCF對沉默DDIT4后小鼠肝細胞生物學功能的影響發現:1.AML-12細胞增殖;2.AML-12細胞凋亡、自噬數量減少。