液相色譜-串聯質譜法測定大豆中噻呋酰胺殘留量

李巧蓮，肖舒元，蔣笑妍，王巖松*

分析檢測

液相色譜-串聯質譜法測定大豆中噻呋酰胺殘留量

李巧蓮1，肖舒元1，蔣笑妍2，王巖松1*

（1. 沈陽市食品藥品檢驗所，遼寧 沈陽 110136； 2. 沈陽農業大學 食品學院，遼寧 沈陽 110866）

基于多壁碳納米管優化的 QuEChERS凈化方法，建立了液相色譜-串聯質譜法測定大豆中噻呋酰胺殘留量。利用乙腈對樣品進行提取，優化QuEChERS凈化，在負離子多反應監測模式下分析，C18色譜柱分離，外標法定量。結果表明：在0.1～2.5 μg·L-1的質量濃度范圍內，噻呋酰胺線性關系良好，相關系數（）為0.993 93，方法檢出限為0.4 μg·kg-1，定量限為2.0μg·kg-1。三水平加標試驗的平均回收率為83.4%～92.3%，相對標準偏差為1.4%～6.2%（=6）。該方法操作快捷，凈化效果好，靈敏度高，適用于大豆中噻呋酰胺的定性定量分析。

多壁碳納米管；QuEChERS；液相色譜-串聯質譜法；大豆；噻呋酰胺

噻呋酰胺又稱為噻氟菌胺，結構式見圖1。噻呋酰胺是一種酰胺類廣譜殺菌劑，由美國孟山都公司研發[1]，是一種通過抑制病原菌三羧酸循環阻斷病原菌呼吸鏈而導致其死亡[2-5]的殺菌劑。近年來有關噻呋酰胺分析檢測方法的報道中有邊海濤[6]等利用高效液相色譜-串聯質譜法測定果蔬中噻呋酰胺，宋天瑋[7]等利用氣相色譜檢測小麥中噻呋酰胺，趙小云[8]等利用超高效液相色譜-串聯質譜檢測香蕉中的噻呋酰胺。而《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）中未見大豆的噻呋酰胺限量，氣相色譜-質譜法GB 23200.9—2016中制定糧谷中噻呋酰胺的定量限為0.2 mg·kg-1。因此有必要開展相關方法研究，以期實現大豆中噻呋酰胺殘留痕量分析的目的。

圖1 噻呋酰胺分子結構式

分散固相萃取方法（QuEChERS）)因其速度快、操作方便、消耗有機溶劑較少等優點，在農藥殘留和獸藥殘留的檢測中常被使用[9-13]。QuEChERS方法主要利用無水硫酸鎂等鹽類對樣品進行除水，氧化鋁、石墨化碳黑、十八烷基硅烷鍵合硅膠、N-丙基乙二胺等填料進行混合搭配，清除樣品中的雜質。為改善其凈化能力，金屬有機骨架[14]、共價有機骨架[15]、多壁碳納米管[16]等一些新型吸附材料被用來替換傳統的吸附劑。對比其他新型吸附材料，多壁碳納米管的優勢是比表面積大、化學穩定性和吸附性良好，還具有制備容易、價格低廉等優點，已在農獸藥殘留檢測中被廣泛應用[17-19]。本研究采用多壁碳納米管優化QuEChERS凈化技術與液相色 譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）結合, 建立了大豆中噻呋酰胺殘留量的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜串聯質譜儀，QTRAP 4500，美國應用生物系統公司；電子天平，PTY-B620，華志科技有限公司；電子天平，BS244S-CW，德國賽多利斯儀器有限公司；多功能粉碎機，BJ-1000A，德清拜杰電器有限公司；多管渦旋混勻儀，MS200，杭州瑞誠有限公司；離心機，H1750R，長沙湘儀有限公司。

標準物質噻呋酰胺（純度≥99.8%）、無水硫酸鎂（MgSO4）、石墨化碳黑（GCB）、N-丙基乙二胺吸附劑（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（HC-C18）、多壁碳納米管（MWCNTs），上海安譜有限公司；甲醇、乙腈，色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司；甲酸，分析純, 國藥集團有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

稱取均質的大豆樣品5.00 g于50 mL離心管中，加入10 mL 乙腈，渦旋提取5 min，用離心機在1 000 r·min-1條件下離心3 min，取上清液。重復上述過程一次，合并兩次提取到的上清溶液并混勻待用。在15 mL離心管中分別加入無水MgSO4800 mg 、PSA 200 mg、HC-C18100 mg 、 MWCNTs 25 mg，再加入4 mL上清液，振蕩凈化5 min，靜置取其上清液過0.22 μm有機相濾膜后供分析。

1.2.2 標準溶液的配制

100 ng·mL-1標準中間溶液：準確稱取噻呋酰胺標準物質0.010 0 g，用甲醇溶解并定容至100 mL，冷凍避光保存。

1.2.3 液相色譜條件

C18色譜柱，2.1 mm× 150mm, 3.5 μm。柱溫為40 ℃，進樣體積為10 μL，流速為0.4 mL·min-1。流動相：水相（A）為0.1%的甲酸水，有機相（B）為甲醇。洗脫梯度：0～1 min，10%B；1～3 min，10%B～75%B；3～9 min，75%～95%B；9～10 min，95%B；10～11 min，95%～10%B；11～12 min，10%B。

1.2.4 質譜條件

電噴霧離子源（ESI）；多級反應監測（MRM）模式下，負離子掃描；離子源溫度為650 ℃，電噴霧電壓為-4 500 V；霧化氣的壓力為448 kPa，氣簾氣的壓力為207 kPa，輔助氣的壓力為448 kPa。質譜參數見表1。

表1 噻呋酰胺的質譜參數

注: *為定量離子。

2 結果與分析

2.1 儀器條件的優化

本研究嘗試正負離子掃描方式確定化合物的分子離子峰，噻呋酰胺在負離子全掃描時出現了明顯的[M-H]-分子離子峰。再調節碰撞氣能量打碎母離子，得到子離子碎片，再通過子離子掃描確定子離子碎片信息。選用0.1%甲酸水為水相，對乙腈和甲醇為有機相進行考察，以甲醇為有機相時，可得到無干擾峰的色譜峰，色譜峰峰形對稱尖銳，且質譜響應較高。

綜上，選用負離子掃描方式，水相（A）為0.1%的甲酸水，有機相（B）為甲醇，并采用梯度洗脫程序，按照上述儀器條件對大豆中噻呋酰胺進行檢測分析，得到MRM色譜圖如圖2所示。

圖2 噻呋酰胺MRM色譜圖（0.5 μg·kg-1）

2.2 QuEChERS條件的優化

QuEChERS方法通常利用無水MgSO4、PSA、HC-C18、GCB對試樣進行凈化，分別能吸附試樣中的水分、有機酸、脂類、色素等物質。本研究優化QuEChERS，采用新型吸附材料MWCNTs去除色素和其他具有剛性平面結構的雜質。用交叉優化法選用對噻呋酰胺回收率較高的凈化劑用量。

稱取空白大豆基質5.00 g，添加一定量的噻呋酰胺中間液（1.2.2），使其質量濃度為0.5 μg·kg-1，按照1.2.1步驟前處理，取4組每組5個15 mL的離心管。依次完成4組添加不同量的無水MgSO4、PSA、HC-C18、MWCNTs實驗，不同用量的凈化劑對噻呋酰胺回收率的影響如圖3所示。由圖3可知，無水MgSO4對回收率影響不明顯；PSA 和HC-C18出現明顯回收率下降現象；MWCNTs回收率均低于80%，添加25 mg時回收最佳。

綜上，確定改良后的QuEChERS添加量為 800 mg無水MgSO4、200 mg PSA、100 mg HC-C18和25 mg MWCNTs。

2.3 方法學驗證

2.3.1 檢出限、定量限和線性范圍

在空白大豆試樣中添加噻呋酰胺中間液（1.2.2）使其質量濃度分別為0.1、0.25、0.5、1.25、2.5 μg·L-1，按1.2.1步驟進行操作。配制基質標準曲線，線性方程為=9.972 68e5-6 816.266 220。在0.1～2.5μg·L-1的質量濃度范圍內，相關系數（）為0.993 93，大于0.99，線性關系良好。以信噪比/≥3和/≥10計算檢出限和定量限分別為0.4 μg·kg-1和2.0 μg·kg-1。

2.3.2 回收率和精密度

在5.00 g空白大豆試樣中添加噻呋酰胺中間液（1.2.2），使其質量分數為2.0、5.0、10.0 μg·kg-1，按1.2.1步驟進行操作，進行3水平6平行測定，平均回收率分別為90.1%、92.3%、83.4%，相對標準偏差分別為6.2%、1.4%、2.3%。

3 結 論

本研究采用多壁碳納米管優化QuEChERS凈化技術，并建立了分析大豆中噻呋酰胺的液相色 譜-串聯質譜法。此方法操作簡便、凈化效果顯著、檢出限低、靈敏度和精密度高，可有效應用于大豆中噻呋酰胺的檢測，為殘留限量的制定提供技術 支持。

[1] 王瑞瑞.QuEChERS-液相色譜-串聯質譜法測定蔬菜水果中噻呋酰胺的殘留[J]. 現代食品，2020（17）：185-187.

[2] STEINHAUER D, SALAT M, FREY R, et al. A dispensable paralog of succinate dehydrogenase subunit C mediates standing resistance towards a subclass of SDHI fungicides in Zymoseptoria tritici[J]., 2019, 15(12):e1007780.

[3] YANG D, ZHAO B, FAN Z, et al. Synthesis and biological activity of novel succinate dehydrogenase inhibitor derivatives as potent fungicide candidates[J]., 2019, 67(47): 13185-13194.

[4] HUANG X P, LUO J, LI B X, et al. Bioactivity, physiological characteristics and efficacy of the SDHI fungicide pydiflumetofen against Sclerotinia sclerotiorum[J]., 2019, 160: 70-78.

[5] OLIVEIRA M S, CORDOVA L G, PERES N A. Efficacy and baseline sensitivity of succinate-dehydrogenase-inhibitor fungicides for management of Colletotrichum crown rot of strawberry[J]., 2020, 104(11): 2860-2865.

[6] 邊海濤，蘇春敏，勇艷華，等. 高效液相色譜-串聯質譜法同時測定果蔬中13種琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑[J]. 食品科技，2022， 47（7）：303-308.

[7] 宋天瑋，熊勝，陳恒輝，等. 氣相色譜法快速檢測小麥中醚菌酯和噻呋酰胺的殘留[J]. 農藥，2019，58（4）：285-287.

[8] 趙小云，謝德芳. 超高效液相色譜-串聯質譜對香蕉中苯醚甲環唑和噻呋酰胺農藥殘留的檢測[J]. 江蘇農業科學，2019，47（2）：181-185.

[9] YANG Y, LIN GB, LIU LJ, et al. Rapid determination of multi-antibiotic residues in honey based on modified QuEChERS method coupled with UPLC-MS/MS[J]., 2022, 374 : 131733-131733.

[10] HAN C, HU BZ, CHEN SB, et al. Determination of Xinjunan pesticide residue in foodstuffs of plant origin by a modified QuEChERS method and ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectro- metry[J]., 2021, 151

[11] XANTHIPPE T, MATHIEU D, JOSé F H. A multi-residue pesticide determination in fatty food commodities by modified QuEChERS approach and gas chromatography-tandem mass spectrometry[J]., 2021, 353 : 129039.

[12] SHREOSI B. Development of a QuEChERS-LCMS/MS method for simultaneous estimation of tebuconazole and chlormequat chloride in wheat crop[J]., 2021, 56(3): 212-221.

[13] 張運依，付春艷，陳姣姣. QuEChERS-液質聯用檢測四種水果中的多菌靈[J]. 遼寧化工，2017，46（11）：1144-1146.

[14] 張文敏，馮遵梅，黃川輝，等. 原位溶劑熱聚合法制備金屬有機骨架/碳化氮納米片涂覆的固相微萃取纖維用于紅茶中農藥殘留的高靈敏檢測[J]. 色譜，2020，38（3）：332-340.

[15] 黃斯敏，胡玉斐，陳彥龍，等. 磁性共價有機骨架固相萃取-高效液相色譜測定柑橘中農藥殘留[J]. 分析化學，2020，48（10）：1392-1399.

[16] 翟爭光，賈楠，李昆奇，等. 多壁碳納米管固相萃取/超高效液相色譜-串聯質譜測定烤煙中粉唑醇殘留量[J]. 食品安全質量檢測學報，2020，11（20）：7275-7279.

[17] 張帆，張瑩，黃志強，等. 多壁碳納米管固相萃取/超高效液相色譜-串聯質譜測定茶油中 12 種氨基甲酸酯類農藥[J]. 分析測試學報，2019，38（4）：411-416.

[18] 莫迎，盤正華，蔣湘，等. 多壁碳納米管QuEChERS結合超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞蛋中獸藥多殘留[J]. 食品安全質量檢測學報，2019，10（16）：5443-5452.

[19] MA S, WANG M, YOU TY, et al. Using magnetic multiwalled carbon nanotubes as modified QuEChERS adsorbent for simultaneous determination of multiple mycotoxins in grains by UPLC-MS/MS [J]., 2019, 67(28): 8035-8044.

Determination of Thifluzamide in Soybean by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

1,1,2,1*

（1. Shenyang Food and Drug Inspection Institute, Shenyang Liaoning 110136, China;2. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang Liaoning 110866, China）

An improved QuEChERS purification method based on multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) was established, combined with liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the determination of thifluzamide in soybean. The samples were extracted by acetonitrile, cleaned up with QuEChERS method, separated by C18column, detected by MS/MS in negative ion mode using multiple reaction monitoring (MRM), and finally quantified by the external standard method. The results showed that the calibration curves for thifluzamide showed good linearity with correlation coefficients () of 0.99393 in the concentration range of 0.1～2.5μg·L-1. The limits of detection (LOD) and the limits of quantification (LOQ) of the developed method were 0.4μg·kg-1and 2.0μg·kg-1, respectively. The average recoveries at three levels ranged from 83.4% to 92.3% with relative standard deviations (RSD) of 1.4%～6.2% (=6). This method was fast to operate, showed good purification efficiency and sensitive. This method is suitable for the qualitative and quantitative analysis of thifluzamide in soybean.

Multi-walled carbon nanotubes; QuEChERS; Liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Soybean; Thifluzamide

O657

A

1004-0935（2023）09-1388-04

國家市場監督管理總局科技計劃項目（項目編號：2020MK134）；沈陽市科學技術局科技計劃項目（項目編號：22-322-3-37）。

2022-09-16

李巧蓮（1988-），女，遼寧省沈陽市人，中級工程師，碩士研究生，2014年畢業于沈陽農業大學食品科學專業，研究方向：食品藥品質量安全檢測。

王巖松（1980-），男，高級工程師，博士研究生，研究方向：食品中多種有機污染物檢測方法。