QTRT1表達與腎透明細胞癌預后及腫瘤免疫的相關性

王天云,奎 翔,趙春梅,王 燕

(昆明醫科大學第二附屬醫院病理科,云南 昆明 650032)

腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是高發的泌尿系統腫瘤,相關報告顯示,2020年RCC的新發病例共計431 000例,并有179 000例因RCC死亡[1],其中KIRC是腎細胞癌發病率最高的亞型[2]。由于對化療藥物耐藥和對放療不敏感,KIRC仍以手術切除作為主要的治療方式[3]。該病早期無特異性臨床表現,因此其早期診斷率較低,約1/3的患者在初診時已發生擴散或轉移;即使在手術切除后,仍有近1/3的患者出現復發或轉移[4]。隊列tRNA-核糖基轉移酶1(queuine tRNA-ribosyl transferase 1,QTRT1),有時也稱為tRNA-鳥嘌呤轉糖基酶 (tRNA-guanine trans glycosylase,TGT),位于染色體19p13[5],包含10個外顯子,大約為12 kb。QTRT酶由基因QTRT1編碼,其分子功能是鳥嘌呤與34位的Q堿交換,從而產生超修飾的轉運RNA(transfer RNA,tRNA)[6]。QTRT1是參與 tRNA轉錄后修飾的關鍵酶,這些tRNA是蛋白質合成和細胞信號網絡的核心組成部分,它們的調節可以影響腫瘤進展[7]。研究[8-10]顯示,QTRT1可能通過調節 tRNA參與人結腸腺癌的癌變過程,并且在肺腺癌中顯示了QTRT1的預后價值。然而,QTRT1在KIRC中的作用價值仍然未知,與之相關的研究尚未見報道,現通過數據挖掘探討其在KIRC中的潛在作用,對QTRT1與KIRC之間的關系進行研究,本研究的主要方法是基于Cancer Genome Atlas database(TCGA)數據庫,聯合多個在線數據庫進行數據挖掘,以生物信息學的方法探索QTRT1對KIRC預后以及免疫的影響。

1 資料與方法

1.1分析數據來源 TCGA中KIRC表達譜及表型數據于2022年2月5日下載 (https://xenabrowser.net/datapages/)。驗證的轉錄組數據GSE40435[11]來自于GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi )。

1.2數據處理 所有下載的數據都經過R軟件進行標準化(版本為4.1.2 https://www.r-project.org/ )。

1.3QTRT1蛋白表達分析 R軟件中的“dplyr”包用于對QTRT1與患者臨床病理參數間的聯系進行分析。

使用人類蛋白質圖譜(The Human Protein Atlas HPA, http://www.proteinatlas.org/ )在線數據庫進行QTRT1蛋白在KIRC中表達的分析。

1.4QTRT1與KIRC患者的預后 使用R軟件的“survival”包研究QTRT1表達對KIRC患者預后的影響,并利用“rms”包構建與預后有關的列線圖模型。

1.5基因,蛋白相互作用網絡分析 聯合使用STRING(https://cn.string-db.org/),GENEMAIN(http://genemania.org)2個在線數據庫構建蛋白及基因相互作用網絡。

1.6QTRT1的基因富集分析 利用基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)軟件進行京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析(版本4.2.1 http://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)。

1.7QTRT1與KIRC免疫間的關系 聯合使用Sangerbox 3.0(http://vip.sangerbox.com/home.html)、Gene Expression Profiling interactive Analysis 2(GEPIA2,http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)和TIMER2.0(timer.cistrome.org)等3個在線平臺進行免疫相關分析。

1.8輔以實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應(real-time quartiative polymerase chain reaction,qRT-PCR)法檢測KIRC細胞和正常腎小管上皮細胞中的表達情況 試驗所用的KIRC細胞包括786-O細胞以及Caki-2細胞,正常腎小管上皮細胞為HK2細胞,以上細胞購于武漢普諾賽細胞庫。786-O細胞以10%胎牛血清+1%青霉素和鏈霉素的1640完全培養基培養,Caki-2細胞以10%胎牛血清+1%青霉素和鏈霉素的McCoy′s完全培養基培養,HK2細胞以10%胎牛血清+1%青霉素和鏈霉素的DMEM完全培養基培養。在細胞長滿一個T25培養瓶后提取RNA進行qRT-PCR試驗(試劑為Takara體系)。使用引物:QTRT1:上游-5′ GAAGGGCATCACGACCGAA-3′,下游-5′ CCCGGCCTTAGACCCAGAT-3′;內參引物β-actin:上游-5′-CTCGCCTTTGCCGATCC-3′,下游-5′-TTCTCCATGTCGTCCCAGTT-3′。所得結果使用2-△△Ct法進行數據轉化。

1.9統計學方法 使用R軟件分析數據。計量資料比較采用秩和檢驗、t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗,計數資料比較采用χ2檢驗,生存預后分析使用Kaplan-Meier(K-M)生存分析中的log-rank法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1QTRT1的轉錄組水平表達 通過對TCGA的535例癌和72例正常組織進行秩和檢驗顯示,KIRC組織中QTRT1的表達顯著高于正常組織,差異有統計學意義(P<0.05),見表1。為了排除同一數據集的干擾,GSE40435數據集被用于對結論進行驗證,結果與TCGA數據一致(P<0.05),見表2。KIRC細胞780-O和Caki-2中QTRT1的mRNA表達強度明顯強于正常腎小管上皮細胞HK2,差異有統計學意義(P<0.05),見表3。

2.2QTRT1的表達與KIRC臨床病理參數的關系及該蛋白的表達 將KIRC患者按QTRT1 mRNA表達量的中位數分為QTRT1高表達組和低表達組,并利用卡方檢驗研究QTRT1表達與KIRC臨床病理參數的相關性。QTRT1的mRNA表達在T分期和臨床分期的不同組別間比較差異有統計學意義(P<0.05),見表4。HPA數據庫中收錄了QTRT1的免疫組化染色結果,通過檢索HPA數據庫,顯示QTRT1蛋白呈現胞漿陽性表達,同時在KIRC組織中檢測到中等強度表達,在正常腎組織中檢測到低強度表達,見圖1。

表1 TCGA統計數據比較

表2 TCGA統計數據比較

表3 細胞統計數據比較

表4 QTRT1 mRNA表達在臨床病理特征組間的比較

2.3KIRC預后模型 首先在生存分析中,按QTRT1 mRNA表達量的中位數將患者分為高表達組和低表達組,結果顯示,QTRT1的基因表達與患者總生存期(overall survival,OS),無進展生存期(progression-free survival,PFS)均為正相關(P<0.05),見圖2。以 臨床分期(Ⅰ+Ⅱ=0,Ⅲ+Ⅳ=1)、年齡(<65歲=0,≥65歲=1)、分級(<3級=0,3+4級=1)、M 分期(非M1分期=0,M1分期=1)、T 分期(

圖1 QTRT1蛋白在正常腎組織和KIRC組織中的表達

圖2 QTRT1mRNA表達與預后

圖3 多因素Cox分析森林圖

基于對TCGA數據,本研究構建了預后相關列線圖,利用該圖,可以估算KIRC患者的1年、3年和5年OS(圖4A)。該列線圖的曲線下面積(area under curve,AUC)分別為1年0.84、3年0.81、5年0.78(圖4B);C-指數為0.77,說明列線圖具有較合適的預測強度。如圖4C所示的列線圖校準曲線進一步驗證該模型的使用效能。

表5 多因素Cox分析

圖4 預后列線圖

2.4基因-基因相互作用(gene-gene interaction,GGI)網絡及蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡構建 GeneMANIA被用于構建與QTRT1有關的GGI網絡,網絡中包含的相互作用形式包括物理相互作用(physical interactions),共表達(co-expression),預測(predicted),共定位(co-localization),遺傳相互作用(genetic interactions),通路(pathway),見圖5A,共有19種與QTRT1最具相互作用關系的基因被展示。同時利用STRING平臺構建PPI網絡,并顯示了與QTRT1相互作用的10種蛋白質,見圖5B。

圖5 基因、蛋白相互作用網絡

2.5GSEA富集分析和腫瘤突變負荷(tumor mutation burden,TMB) 通過GSEA軟件得到了賴氨酸降解(KEGG_LYSI NE_D EGRADATION), 甘油脂代謝(KEGG_GLYCEROLIPID_METABOLISM),溶酶體(KEGG_LYSOSOME),泛酸和輔酶A 生物合成(KEGG_PANTOTHENATE_AND_COA_BIOSYNTHESIS)等4種與QTRT1表達有關的信號通路(圖6A,表6)。利用Sangerbox得到了QTRT1與腫瘤突變負荷Tumor Mutation Burden(TMB)間的關系,在KIRC中QTRT1與TMB呈現正相關(P<0.05,R>0,圖6B)。

圖6 GSEA富集分析

表6 QTRT1富集分析結果。

2.6QTRT1與免疫之間的關系 利用TIMRE2.0網站,并使用其中的XCell算法,探究QTRT1mRNA表達同免疫細胞浸潤之間的關系。在眾多的免疫細胞中,CD4陽性的Th1細胞(P<0.001,r=-0.329)、巨噬細胞(P<0.001,r=-0.329)、淋巴樣祖細胞(P<0.001,r=-0.231)、樹突狀細胞(P<0.001,r=-0.295)、單核細胞(P<0.001,r=-0.15)等5種免疫細胞的浸潤程度與QTRT1表達呈現負相關,而CD4陽性的Th2細胞(P<0.001,r=0.243)呈現正相關。并且,還用TIDE算法研究QTRT1與髓源抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells MDSCs)間的聯系,顯示MDSCs與QTRT1正相關(P<0.001,r=0.196如圖7A所示)。此外,QTRT1與多個免疫檢查點基因和免疫細胞途徑均具有強相關性(P<0.001),見圖7B,C。在Stromal Score評分模式下,KIRC中QTRT1的表達與免疫微環境顯著負相關,見圖7D。最后使用GEPIA2網站進行了QTRT1與3個常用的免疫檢查點基因相關性的研究,見圖7E,QTRT1與PTCD1(PD1)、CD152(CTLA4)免疫檢查點分子顯著正相關(P<0.05,r>0)。以上結果都說明QTRT1與KIRC的免疫密切相關。

圖7 QTRT1與腫瘤免疫的關系

3 討 論

TCGA、GEO等眾多生物醫學數據庫的建立,使得分子生物數據得以共享,加之計算機科學和統計學的迅猛發展,生信分析技術日趨成熟。通過生信分析得出初步結論,再進行實驗和臨床研究驗證,大大節省了研究資金和時間,也為科學研究帶來了更多的思路和方向[12-13]。如前所述,已有研究報告了QTRT1與結直腸癌、肺腺癌等腫瘤的聯系,但該基因與KIRC間關系的研究尚未見報道。生信分析顯示QTRT1在KIRC中顯著上調,并且腫瘤的分期愈高該基因的表達也愈高。同時在Caki-2和786-O腎癌細胞系中,QTRT1 mRNA的表達水平明顯強于正常腎小管上皮細胞HK-2。而在HPA數據庫中,通過檢索顯示QTRT1蛋白在KIRC中為胞漿陽性表達,并且其在癌和正常組織中表達強度差異有統計學意義。K-M曲線顯示,高表達的QTRT1是KIRC患者的不良預后因素。Cox回歸分析進一步提示QTRT1和年齡、分級、M 分期可以作為KIRC患者OS的獨立預后因素。根據現有數據可以構建以QTRT1和年齡、分級、M分期等參數為基礎的列線圖預后模型;當已知KIRC患者的上述參數時,根據模型計算出總分數,就能得出患者的1年、3年、5年OS的概率。因此,本研究構建了基于QTRT1表達的列線圖模型,該模型可以更加精確地指導KIRC患者的預后。

在GSEA富集分析中,QTRT1高度富集的4個信號通路被篩選出來,這些通路可以幫助我們更好地理解KIRC致病的病理生理機制。GGI和PPI相互作用網絡的構建呈現了多個與QTRT1有關的生物分子,這些生物分子的顯示給KIRC的研究帶來了更多的思路和切入點。

惡性腫瘤的高發病率和高病死率是現代醫學無法回避的問題,而在抗擊腫瘤的道路上,人類取得了斐然的成績,先后創立了多種治療方式。其中免疫治療是近30年來發展壯大的臨床治療方法,已經在多種腫瘤中運用,并取得了理想的治療效果,如運用于惡性黑色素瘤、肺癌和淋巴瘤[14-16]。免疫治療對患者正常細胞的影響較小,是一種相對安全的方法,免疫治療也是當下的研究熱點。本研究QTRT1與TMB免疫治療效果預測因子聯系緊密,猜測后者可以在預測KIRC患者免疫治療反應中發揮作用。此外,在KIRC中QTRT1與CD4陽性的Th1、巨噬細胞、淋巴樣祖細胞、樹突狀細胞、單核細胞負相關,同時其表達與MDSC的浸潤程度正相關,可能導致腫瘤免疫微環境的抑制。MDSCs來源于骨髓,對免疫系統有抑制作用。MDSC可以產生一氧化氮和活性氧,后者可以硝酸化趨化因子并阻止CD8+T細胞進入腫瘤[17]。MDSC會產生免疫抑制細胞因子,包括 IL-10和TGF-β,會誘導T細胞生成。研究[18-21]表明,MDSCs 與肝細胞癌、胰腺癌、乙型肝炎、尿路上皮癌等疾病的預后和治療密切相關。因此QTRT1可能參與塑造了KIRC中免疫抑制的微環境,這很可能造成該腫瘤的進一步發展并影響患者預后(QTRT1作為預后不良因子的佐證),免疫抑制狀態也是一把雙刃劍,當消除其干擾時,也可能使腫瘤擺脫免疫抑制并激活免疫系統的抗腫瘤作用。同時,在KIRC中QTRT1還與多個免疫檢查點(如PD1和CTLA4等)具有顯著相關性。

本研究不僅通過TCGA數據集和GEO數據集分析了QTRT1 mRNA在人體組織中的表達,還通過qRT-PCR實驗在細胞水平上進行基因表達驗證,同時通過HPA數據庫探尋其蛋白質表達,從基因到蛋白全面分析了該因子的表達情況。 此外,還分析了KIRC中QTRT1的多種元素,包括列線圖、GSEA、TMB、PPI、GGI、腫瘤免疫浸潤、免疫細胞通路和檢查點分子。

綜上所述,QTRT1是KIRC的潛在預后因子,與4種信號通路相關,還與免疫治療密切相關。但是,本研究同樣存在不足之處。由于是回顧性數據,來自TCGA的臨床信息有限,無法獲得各種重要數據,包括潛在的慢性疾病、免疫療法的使用、腎切除術后復發等。研究主要基于生信分析,缺少基礎實驗驗證。TCGA中正常腎組織(N = 72)的樣本量相對較小,這可能會導致一些偏差。