脯氨酰4-羥化酶α亞單位3 在胃癌中的表達及臨床意義

吳海蘭，丁永玲，王正

揚州大學附屬醫院病理科，江蘇 揚州 225000

全球癌癥統計數據顯示，2018 年胃癌發病率居全部惡性腫瘤第5 位，病死率居全部惡性腫瘤第3 位，具有病死率高、預后差的特點[1]。近年來，雖然胃癌的治療及預后研究取得了一定進展，但已接受根治手術或有效放化療患者的5 年生存率仍較低（﹤40%）[2]。因此，尋找與胃癌發生發展和預后相關的標志物具有重要意義。脯氨酰4-羥化酶（prolyl 4-hydroxylase，P4H）是一種高度保守的能夠維持膠原穩定的必需酶，它是由2 個α亞基和2個β亞基組成的四聚體，而脯氨酰4-羥化酶α亞單位（prolyl 4-hydroxylase subunit alpha，P4HA）作為酶的活性位點，被鑒定為具有3 種α亞基，P4HA1基因編碼α（Ⅰ），P4HA2基因編碼α（Ⅱ），P4HA3基因編碼α（Ⅲ），其中P4HA1 最為普遍[3]，P4HA2主要在成骨細胞、軟骨細胞和毛細血管內皮細胞中表達[4]，P4HA3 在正常胎兒和成人組織中低表達[5]。既往研究報道，結直腸癌[5-7]、垂體腺瘤[8]、頭頸部鱗狀細胞癌[9]、乳腺癌[10]、肺癌[11]中P4HA3 表達水平均較高，P4HA3 能夠促進腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移，且其表達水平與腫瘤患者的預后有關，然而P4HA3 與胃癌發生、發展及預后的關系卻少有報道。本研究首先通過生物信息學分析胃癌中P4HA3基因表達情況及與患者預后的關系，然后通過免疫組織化學染色法在蛋白水平上進一步驗證，探討P4HA3 在胃癌發生發展中的作用，旨在為胃癌的診斷和治療提供新思路，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 生物信息學數據收集與處理

通過UALCAN 數據庫[12]（http://ualcan.path.uab.edu/）分析癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫中胃癌組織和癌旁正常組織中P4HA3基因表達差異，并進一步分析TCGA 數據庫中不同臨床分期、分化程度、年齡和性別胃癌患者P4HA3基因表達差異。合并來自GPL570 的3 個基因表達綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數據庫中的胃癌數據集，分別為GSE13911、GSE79973和GSE19826。對3 個數據集進行log2（X）轉化，并利用R 包“sva”進行數據合并和去批次效應。提取基因名為“P4HA3”的基因表達值，采用R 包“ggplot2”比較癌旁正常組織和胃癌組織中P4HA3基因表達量的差異。以P4HA3基因表達中位值為界，將患者分為P4HA3 高表達組和P4HA3 低表達組，采用Kaplan-Meier plotter 在線數據庫比較兩組患者的總生存時間、首次進展生存時間和進展后生存時間。

1.2 臨床資料收集

收集2008 年1 月至2012 年12 月于揚州大學附屬醫院行胃癌根治術的胃癌患者。納入標準：①經病理檢查確診為胃癌；②無免疫系統疾??；③術前未接受過化療、放療或其他抗腫瘤治療。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②臨床資料不完整。依據納入和排除標準，本研究共納入107 例胃癌患者，收集患者的胃癌組織及癌旁正常組織石蠟切片。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意。

1.3 免疫組織化學染色法檢測P4HA3 蛋白表達及結果判定

免疫組織化學染色步驟：石蠟切片脫蠟水化，抗原修復，滴加內源性過氧化物酶阻斷劑，山羊血清封閉，滴加一抗P4HA3（1∶150）4 ℃冰箱孵育過夜，復溫，滴加二抗山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）室溫反應30 min，最后二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復染，脫水封片，顯微鏡觀察。

P4HA3 蛋白主要定位于細胞質，由2 位經驗豐富的病理科醫師閱片，每張切片選取2個視野，于高倍鏡（×200 和×400）下計數200 個細胞，采用半定量法，根據染色強度和陽性細胞所占比例進行評分。染色強度評分：無色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。陽性細胞所占比例評分：無陽性細胞為0 分，陽性細胞所占比例≤25%為1 分，陽性細胞所占比例26%～50%為2 分，陽性細胞所占比例51%～75%為3 分，陽性細胞所占比例﹥75%為4 分。染色強度評分與陽性細胞所占比例評分相乘，0～2分為陰性（-），3～5分為弱陽性（+），6～8分為中等陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。

1.4 隨訪方法

以門診或電話等方式對胃癌患者進行隨訪，特殊患者必要時上門回訪，隨訪截止時間為2022 年12 月?？偵鏁r間為術后至隨訪截止時間或患者死亡時間。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Spearman 相關分析法進行相關性分析；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗；以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TCGA、GEO 數據庫中胃癌組織和癌旁正常組織P4HA3 基因表達水平的比較

基于TCGA 數據庫對胃癌組織和癌旁正常組織中P4HA3基因表達情況進行分析，結果顯示，胃癌組織（n=415）中P4HA3基因表達水平明顯高于癌旁正常組織（n=34），差異有統計學意義（P﹤0.01）。合并的3 個胃癌GEO 數據集顯示，胃癌組織（n=60）中P4HA3基因表達水平為（5.810±1.140），明顯高于癌旁正常組織（n=53）的（5.165±0.821），差異有統計學意義（P﹤0.01）。（圖1）

2.2 TCGA 數據庫中不同臨床特征胃癌患者P4HA3 基因表達水平的比較

利用UALCAN 工具分析TCGA 數據庫中不同臨床特征胃癌患者P4HA3基因表達水平，結果顯示，不同性別胃癌患者的P4HA3基因表達水平比較，差異無統計學意義（P﹥0.05）；不同年齡、分化程度、臨床分期胃癌患者的P4HA3基因表達水平比較，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。（圖2）

2.3 胃癌組織和癌旁組織中P4HA3蛋白表達情況的比較

107 例胃癌患者的胃癌組織中P4HA3 蛋白陽性表達率為80.4%（86/107），高于癌旁正常組織的15.9%（17/107），差異有統計學意義（χ2=4.935，P=0.026）。

2.4 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中P4HA3 蛋白表達情況的比較

不同腫瘤直徑、分化程度、TNM 分期、T 分期胃癌患者胃癌組織中P4HA3 蛋白表達情況比較，差異均有統計學意義（P﹤0.05）；不同性別、年齡、N 分期、M 分期胃癌患者胃癌組織中P4HA3 蛋白表達情況比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05）。（表1、圖3）

表1 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中P4HA3 蛋白表達情況的比較

圖3 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中P4HA3蛋白表達情況（免疫組織化學染色，×200）

2.5 不同P4HA3 表達情況胃癌患者預后的比較

2.5.1 P4HA3 陽性表達與P4HA3 陰性表達胃癌患者預后的比較 采用Kaplan-Meier 法繪制胃癌患者的生存曲線，結果顯示，P4HA3 陽性表達患者的中位總生存時間為38.5 個月，P4HA3 陰性表達患者的中位總生存時間為73.0 個月；P4HA3 陰性表達患者的累積生存率明顯高于P4HA3陽性表達患者，差異有統計學意義（χ2=14.570，P﹤0.01）。（圖4）

圖4 P4HA3陽性表達（n=86）與P4HA3陰性表達（n=21）胃癌患者的總生存曲線

2.5.2 P4HA3 高表達組和P4HA3 低表達組胃癌患者預后的比較 Kaplan-Meier plotter 在線數據庫分析發現，P4HA3 高表達組患者的中位總生存時間明顯短于P4HA3 低表達組，差異有統計學意義（35.9 個月vs78.6 個月，P﹤0.01）；P4HA3 高表達組患者中位首次進展生存時間明顯短于P4HA3 低表達組，差異有統計學意義（21.9 個月vs75.5 個月，P﹤0.01）；P4HA3 高表達組患者中位進展后生存時間明顯短于P4HA3 低表達組，差異有統計學意義（8.4 個月vs17.1 個月，P﹤0.01）。（圖5）

圖5 Kaplan-Meier plotter在線數據庫中P4HA3高表達組和P4HA3低表達組胃癌患者的生存曲線

3 討論

P4HA3 首次在人頸動脈粥樣硬化病變的纖維帽中發現，其可參與膠原的合成，雖然P4HA3 在正常組織中表達水平較低，但在多種類型腫瘤中高表達[13]。研究顯示，結直腸癌組織中P4HA3 表達水平明顯高于正常結直腸組織，其可促進結直腸癌細胞生長和轉移[6]。另有研究報道，在垂體腺瘤[8]、頭頸部鱗狀細胞癌[9]、乳腺癌[10]、肺癌[11]中，P4HA3 呈高表達，且其表達水平與腫瘤患者的預后相關。此外，研究還發現，上皮-間充質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）誘導劑轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）可通過誘導P4HA3 表達來改變氨基酸代謝，從而導致體外和體內的腫瘤細胞具有惡性特征，說明P4HA3抑制劑可能是潛在的抗腫瘤藥物[11]。然而P4HA3在胃癌中的作用卻少有報道。

本研究通過UALCAN 數據庫分析TCGA 數據庫中胃癌組織和癌旁正常組織中P4HA3基因表達水平，發現胃癌組織中P4HA3基因表達水平明顯高于癌旁正常組織，差異有統計學意義（P﹤0.01），隨后分析了TCGA 數據庫中不同臨床特征胃癌患者P4HA3基因表達水平，發現不同年齡、分化程度、臨床分期胃癌患者的P4HA3基因表達水平比較，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。為驗證TCGA 數據庫中顯示的結果，本研究合并了來自GPL570 的3 個GEO 胃癌數據集，發現癌旁正常組織中P4HA3基因表達水平明顯低于胃癌組織，差異有統計學意義（P﹤0.01），提示P4HA3 的表達可能與胃癌的發生發展有關。為進一步驗證P4HA3表達與胃癌患者預后的關系，本研究應用Kaplan-Meier plotter 在線數據庫比較P4HA3 高表達組和P4HA3 低表達組患者的生存情況，結果顯示，P4HA3 高表達組患者的中位總生存時間、中位首次進展生存時間、中位進展后生存時間均明顯短于P4HA3 低表達組，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。表明P4HA3 高表達與胃癌患者的預后不良有關。

有研究通過體外細胞實驗證實P4HA3 能夠促進胃癌細胞侵襲和轉移，并提示其與胃癌預后相關[14-15]，但是缺乏來源于人體組織的驗證。本研究收集107 例胃癌患者胃癌組織和癌旁正常組織石蠟標本，采用免疫組織化學染色法檢測P4HA3 蛋白表達情況，并結合臨床特征及隨訪資料進行綜合分析，發現胃癌組織中P4HA3 蛋白表達水平明顯高于癌旁正常組織，差異有統計學意義（P﹤0.01）；不同腫瘤直徑、分化程度、TNM 分期、T 分期胃癌患者胃癌組織中P4HA3 蛋白表達情況比較，差異均有統計學意義（P﹤0.05）；P4HA3 陰性表達患者的累積生存率明顯高于P4HA3 陽性表達患者（P﹤0.01），與生物信息學分析結果一致。以上結果均表明P4HA3 表達升高與胃癌的惡性生物學行為密切相關，并且很可能成為胃癌的預后評估指標和潛在治療靶點，但其在胃癌中的具體作用機制有待進一步深入研究。

綜上所述，P4HA3 在胃癌組織中高表達，且與胃癌的發生發展及預后有關，可能成為胃癌的預后評估指標和潛在治療靶點。