tribbles 同源物1 在前列腺癌組織中的表達及與患者臨床特征的關系

鄭香玉，吳光鋒，付勇先，范瑞

南陽市第一人民醫院病理科，河南 南陽 473000

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是最常見的男性生殖系統惡性腫瘤，每年超過25 萬例患者死于該病，病死率居男性惡性腫瘤第5 位[1-2]。PCa 確診后可采取前列腺切除術或放療等一線治療，然而，仍有部分患者會在治療數月至數年后出現復發且血液前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）水平升高。不同種族的PCa 患者基線PSA 水平不同，部分患者無法準確診斷，因此，早期診斷和評估疾病進展情況對治療方案的制訂和預后改善具有很大影響。tribbles 同源物1（tribbles homolog 1，TRIB1）屬于tribbles 家族成員之一，可以通過與許多調節細胞活性的蛋白質相互作用，參與腫瘤的發生[3]。目前已有研究證實TRIB1 能夠直接或間接地參與PCa 的發生發展[4]。本研究探討TRIB1 在PCa 組織中的表達及與患者臨床特征的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年1 月至2021 年12 月南陽市第一人民醫院收治的PCa 患者。納入標準：①經病理檢查確診為PCa；②年齡50～75 歲；③臨床資料完整。排除標準：①病理組織呈現神經內分泌分化；②合并嚴重的器質性疾病；③合并精神疾病。依據納入和排除標準，本研究共納入92 例患者，年齡57～72 歲；T 分期[5]：T1～2期42 例，T3期50 例；PSA 水平：≤20 ng/ml 36 例，﹥20 ng/ml 56 例；轉移負荷[6]：高轉移負荷（指存在內臟轉移，或骨轉移灶4 個以上，并且至少有1 個骨盆或脊柱以外的轉移）44 例，低轉移負荷48 例；Gleason 評分：≤7 分49 例，8～9 分43 例。本研究經醫院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意。

1.2 主要材料

1.2.1 儀器 CFX Connect Real-time PCR 擴增儀、iMark 型酶標儀均購自美國Bio-Rad 公司，全自動免疫組化預處理系統PT link 和全自動免疫組化染色系統Autostain Link 48 均購自丹麥DAKO 公司，Tanon 5200 Multi 型全自動化學發光系統購自天能科技有限公司，OSE-Y30 型電動組織研磨器購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2.2 試劑 cDNA 合成試劑盒、Real-time PCR 試劑盒均購自北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司，PSA 試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司；蘇木素、伊紅染色液均購自貝索生物技術有限公司，TRIzol 試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司，TRIB1 抗體購自上海優寧維生物科技股份有限公司。

1.3 免疫組化染色法檢測TRIB1 蛋白表達情況及結果判定

收集PCa 患者的PCa 組織和癌旁組織，采用免疫組化染色法檢測TRIB1 蛋白表達情況。組織標本經福爾馬林固定，脫水，并嵌入到蠟塊中，采用微型切片機將樣本切成4～6 μm 薄片，并將切片放置在玻片上。由于石蠟包埋可能會掩蓋蛋白質的抗原決定位點，因此需要使蛋白質抗原重新暴露。酶解后選取TRIB1 特異性抗體，進行熒光標記，清洗去除未結合的抗體，減少背景信號。應用緩沖液對組織切片進行多次洗滌。加入適當的底物二氨基聯苯胺，使酶標記的抗體形成棕色沉淀。熒光標記的抗體可以直接在熒光顯微鏡下觀察。在另一塊組織切片上使用陰性對照和陽性對照。染色完成后，用適當的封片劑將組織切片密封，然后顯微鏡下觀察。

采用半定量法評價免疫組化染色結果。染色強度評分：無色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2分，棕褐色為3 分。陽性細胞百分比評分：無陽性細胞為0 分，﹤10%為1 分，10%～30%為2 分，31%～50%為3 分，﹥50%為4 分。染色強度評分與陽性細胞百分比評分相乘，≤3 分為（-），4～6 分為（+），7～9 分為（++），10～12 分為（+++），0～6 分判定為陰性，7～12 分判定為陽性。

1.4 實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測TRIB1 mRNA相對表達量

采用TRIzol 法提取PCa 組織和癌旁組織總RNA，根據試劑盒說明書進行逆轉錄，合成cDNA。以cDNA 為模板進行PCR 擴增。PCR 反應體系：2×PCR buffer 10 μl，ddH2O 6 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各1 μl。PCR 反應：95 ℃30 s 預變性，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40 個循環；溶解曲線：95 ℃5 s 變性，60 ℃1 min 退火，95 ℃1 s 退火，50 ℃30 s 冷卻。以GAPDH為內參，采用2–△△Ct法計算TRIB1mRNA相對表達量。TRIB1上游引物5'-CCTTCGTGATCCTCTACA-3'，下游引物5'-TGGCTTTCGCCCAAACAT-3'；GAPDH上游引物5'-ACCCCACTATCTC- 3'，下游引物 5'- TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'。根據受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線計算cut-off 值，以PCa 組織中TRIB1mRNA 相對表達量的中位值1.989 為臨界值，≥1.989 為高表達，﹤1.989 為低表達。

1.5 觀察指標

比較PCa 組織和癌旁組織中TRIB1mRNA 相對表達量及TRIB1 蛋白表達情況，比較不同臨床特征PCa 患者PCa 組織中TRIB1mRNA 表達情況，分析TRIB1mRNA 表達與PCa 患者臨床特征的相關性。

1.6 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Kendall 相關分析。以P﹤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TRIB1 蛋白表達情況的比較

PCa 組織中TRIB1 蛋白陽性表達率為88.04%（81/92），明顯高于癌旁組織的11.96%（11/92），差異有統計學意義（χ2=106.522，P﹤0.01）。免疫組化染色結果顯示，PCa 組織中TRIB1 蛋白評分為（9.37±1.16）分，明顯高于癌旁組織的（5.36±1.25）分，差異有統計學意義（t=22.555，P﹤0.01）。PCa組織中TRIB1 蛋白呈強陽性表達，細胞核為棕黃色或褐色，而癌旁組織中TRIB1 蛋白呈陰性表達，細胞核未著色（圖1）。

圖1 PCa組織和癌旁組織中TRIB1蛋白表達情況（免疫組化染色，×200）

2.2 TRIB1 mRNA 相對表達量的比較

PCa 組織中TRIB1mRNA 相對表達量為（2.002±0.287），明顯高于癌旁組織的（1.793±0.134），差異有統計學意義（t=6.329，P﹤0.01）。92例患者中，TRIB1mRNA 高表達53 例，TRIB1mRNA 低表達39 例，TRIB1mRNA 高表達患者的TRIB1mRNA 相對表達量為（2.244±0.062），明顯高于TRIB1mRNA 低表達患者的（1.675±0.017），差異有統計學意義（t=55.719，P﹤0.01）。

2.3 不同臨床特征PCa 患者PCa 組織中TRIB1 mRNA 表達情況的比較

不同確診年齡PCa 患者PCa 組織中TRIB1mRNA 表達情況比較，差異無統計學意義（P﹥0.05）；T3期、PSA水平﹥20 ng/ml、高轉移負荷、Gleason評分為8～9分PCa患者PCa組織中TRIB1mRNA高表達率分別高于T1～2期、PSA水平≤20 ng/ml、低轉移負荷、Gleason 評分≤7 分的患者，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。（表1）

2.4 TRIB1 mRNA 表達與PCa 患者臨床特征的相關性

Kendall 相關性分析結果顯示，TRIB1mRNA 表達與PCa 患者的轉移負荷無相關性（P﹥0.05），TRIB1mRNA 表達與PCa 患者的T 分期、PSA 水平以及Gleason 評分均呈正相關（r=0.318，P=0.002；r=0.214，P=0.042；r=0.275，P=0.009）。

3 討論

目前PCa 是最常見的一種泌尿系統惡性腫瘤，其發病率呈逐年上升趨勢[7]。PCa 已經成為一種嚴重危害男性生命健康的疾病。PCa 的異質性較大，有些PCa 的惡性程度很低，進展較慢，不需要正規治療，但有些PCa 的惡性程度較高，侵襲性較強，進展較快，需進行相應治療，從而改善患者預后[8-9]。目前為止，臨床上還沒有明確的PCa 危險度評估標準，而一些有經驗的臨床醫師會通過綜合評估患者的Gleason 評分、腫瘤分期、血清PSA 水平等預測病情發展情況，并對其風險進行預估。因此，尋找更多的標志物評價PCa 的惡性程度，對于治療方案的制訂非常重要。TRIB 蛋白是由3 個成員組成的絲氨酸/蘇氨酸假激酶家族，包括TRIB1、TRIB2和TRIB3[10]。TRIB 家族蛋白由多種細胞應激因子和有絲分裂因子活化，在腫瘤發生發展過程中扮演重要角色。TRIB1基因定位于染色體8q24.13，與c-Myc非常接近[11]。有學者發現，TRIB1 能夠控制與惡性腫瘤侵襲性相關的細胞功能[12]。Yoshino等[13]研究發現，TRIB1基因過表達能夠促進同源盒A9（homeobox A9，HOXA9）所致白血病的發生，提示TRIB1 可能是一個很好的預測指標。與此同時，Kim 等[14]研究發現，TRIB1 在乳腺癌中表達水平較高，其表達與患者生存率有關，而且TRIB1 是一種先前不知道的抗腫瘤細胞因子白細胞介素（interleukin，IL）-15 的負調控因子，可使乳腺癌中IL-15 水平下降，從而引起T 淋巴細胞數目減少。相關研究表明，TRIB1 在腫瘤發生發展過程中具有重要作用[15]。Shahrouzi 等[16]研究顯示，TRIB1是PCa 患者的8q24 擴增子中最穩健上調的編碼基因之一，其轉錄受c-Myc 調控，小鼠建模和功能分析結果表明，TRIB1異常表達是PCa發生的重要原因。

本研究發現，PCa 組織中TRIB1 蛋白陽性表達率明顯高于癌旁組織，表明TRIB1 在PCa 組織中過表達。Singh 等[17]研究發現，TRIB1基因過表達可能會加速惡性腫瘤的發生。并且，研究者在觀察PCa組織和正常前列腺組織中TRIB1 表達水平時發現，與正常前列腺組織相比，PCa 組織中TRIB1mRNA 和蛋白表達水平均增加了3 倍以上[18]。此外，本研究結果顯示，T3期、PSA 水平﹥20 ng/ml、高轉移負荷、Gleason 評分為8～9 分PCa 患者PCa 組織中TRIB1mRNA 高表達率分別高于T1～2期、PSA 水平≤20 ng/ml、低轉移負荷、Gleason 評分≤7 分的患者，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。T 分期可反映腫瘤細胞的侵襲能力。PSA 由前列腺上皮細胞合成和分泌，許多類型前列腺疾病患者的血漿PSA水平異常升高，其對PCa 的診斷具有重要的參考意義。Gleason 評分是一種常見的病理分級方法，可以精確地評價腫瘤細胞的生物學行為。本研究結果提示TRIB1 過表達在PCa 發生發展過程中具有重要意義。Zhang 等[19]研究報道，TRIB1 能夠通過抑制核因子κB 抑制因子ζ（inhibitor of nuclear factor-κB zeta，NFKBIZ）的表達促進C-X-C 趨化因子配體（C-X-C motif chemokine ligand，CXCL）和IL-8分泌，并誘導腫瘤生長。Liu 等[20]研究發現，TRIB1通過上調葡萄糖調節蛋白78（glucose-regulated protein 78 kD，GRP78）的表達促進前列腺癌的發生發展。上述結論也證實了TRIB1 異常表達可能促進PCa 進展，從而使其成為PCa 診斷和預后評估的新型潛在生物標志物。

綜上所述，TRIB1 可能參與PCa 的發病過程，同時PCa 的惡性程度與TRIB1mRNA 表達水平有關，研究TRIB1mRNA 表達水平對PCa 的診斷和臨床治療均具有重要意義。