7 種殺菌劑對藜麥葉斑病菌的室內毒力測定及其分生孢子萌發形態的影響

呂 紅，秦 楠，田 淼，彭玉飛，任 璐，殷 輝，趙曉軍

（山西農業大學 植物保護學院，山西 太原 030031）

藜麥（Chenopodium quinoaWilld.）是莧科藜屬1 年生雙子葉草本植物，原產于安第斯山脈，在玻利維亞和秘魯已有5 000～7 000 a 的栽培歷史，是印第安人的傳統食物，因其具有獨特的營養價值，被印第安人稱為“糧食之母”[1-3]。近年來，藜麥已發展成為雜糧“新寵”[4]。

我國藜麥種植與產業發展開始于20 世紀90 年代，目前我國藜麥產區分布在內蒙古、西藏、青海、河北、甘肅、山西、吉林、四川、北京等20 余省，2020 年我國藜麥種植面積約20 000 hm2，總產量約2.88 萬t，種植面積和產量已躍居世界第3 位[5-6]。2008 年藜麥在山西省靜樂縣引種成功，自試種成功以來，藜麥種植面積逐年擴大，當前山西省藜麥種植面積超過4 000 hm2[7]，主要集中在忻州市靜樂縣、五臺縣、原平縣、繁峙縣、岢嵐縣等。靜樂縣是山西省主要藜麥產區，2022 年靜樂縣藜麥種植面積約3 300 hm2。目前藜麥產業市場廣闊、發展勢頭強勁[8]。

鏈格孢葉斑病菌（Alternaria alternata）引起的鏈格孢葉斑病是藜麥常見的一種病害，在我國內蒙古自治區、西藏自治區和山西省藜麥種植區均有發生，嚴重影響藜麥種植的經濟效益[9-11]。該病害于6 月至8 月上旬發病，在葉片上形成黃綠或黃棕色近圓形病斑，表面附著黃綠色霉層，且多個病斑易連接成片，導致葉片枯裂易脫落。目前，主要通過化學藥劑來防治鏈格孢引起的植物病害，如陶航等[12]研究表明，嘧菌酯和吡唑醚菌酯乳油對芍藥黑斑病菌（A.alternata）的抑制作用較強；劉俏等[13]對櫻桃葉斑病菌（A.alternata）進行室內毒力測定，結果發現，250 g/L 嘧菌酯懸浮劑抑菌效果最好，其EC50值為1.26 μg/mL。目前仍未見使用登記的農藥來防治藜麥病害，因此，對鏈格孢葉斑病的防治存在一定的盲目性。

本研究測定了7 種殺菌劑對藜麥鏈格孢葉斑病菌（A.alternata）的室內毒力，以期為該病害的防治藥劑篩選奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 于山西省忻州市藜麥種植區（38.466 9°N，112.725 1°E）采集藜麥葉斑病葉片，經前期分離鑒定確定該致病菌為鏈格孢葉斑病菌（Alternaria alternata）[11]。

1.1.2 供試藥劑 97.2% 咪鮮胺（Prochloraz）原藥，山東濰坊潤豐化工有限公司；96.8%苯醚甲環唑（Difenoconazole）原藥，杭州大陽化工有限公司；98.4% 甲基硫菌靈（Thiophanate-methyl）原藥，山東西亞化學工業有限公司；95%腈菌唑（Myclobutanil）原藥，浙江禾本科技股份有限公司；95%丙環唑（Propiconazole）原藥，青島恒寧生物科技有限公司；97%啶酰菌胺（Boscalid）原藥，陜西美邦藥業集團股份有限公司；92%吡唑萘菌胺（Isopyrazam）原藥，瑞士先正達作物保護有限公司。以上原藥均用丙酮配制成10 000 μg/mL 的母液，4 ℃冰箱保存備用。

1.1.3 培養基、儀器和設備 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基1 000 mL：馬鈴薯浸粉6.0 g、瓊脂20.0 g、葡萄糖20.0 g（上述試劑為索萊寶公司，北京）。121 ℃高壓蒸氣滅菌20～30 min。試驗主要儀器和設備為超凈工作臺、滅菌鍋和恒溫培養箱等。

1.2 試驗方法

1.2.1 7 種殺菌劑對病原菌菌絲生長的毒力測定采用菌絲生長速率法測定殺菌劑對病原菌菌絲生長的室內毒力[14]。將A.alternata置于PDA 培養基上25 ℃培養7 d，取菌餅（5 mm）備用；將滅菌后的PDA 培養基冷卻至50 ℃左右備用。用無菌水將7種殺菌劑母液分別稀釋成5 個質量濃度梯度，以藥劑∶PDA 體積比為1∶9 制備成含藥平板，含藥平板最終藥劑質量濃度如表1 所示，在PDA 中加入相同體積的丙酮作為對照。25 ℃恒溫培養箱培養，重復3 次。培養7 d 后用十字交叉法測定菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。將菌餅接種到含有不同質量濃度殺菌劑的PDA 培養基上，置于25 ℃恒溫培養箱中培養7 d 后，用十字交叉法測定菌落直徑，并計算各個質量濃度藥劑對代表性菌株的菌絲生長抑制率。

表1 7 種殺菌劑的藥劑質量濃度Tab.1 Concentrations of the seven fungicides μg/mL

1.2.2 7 種殺菌劑對病原菌分生孢子萌發的室內毒力測定 采用孢子萌發法測定殺菌劑對病原菌分生孢子萌發的室內毒力[15]。收集A.alternata在PDA上培養7 d 的分生孢子于1.5 mL 無菌離心管中，加入無菌水配成孢懸液（1.0×105個/mL）。采用涂片法，將含藥PDA均勻涂布于無菌載玻片（大小約2.5 cm×4.0 cm，厚度約1 mm）上，滴加孢懸液至上述涂片，并將涂片置于鋪有濕潤濾紙的無菌培養皿內進行保濕，含藥涂片最終藥劑質量濃度如表1所示。最后將培養皿置于25 ℃培養箱，重復3 次；6 h 后鏡檢500 個分生孢子的萌發情況，計算分生孢子萌發抑制率。

1.3 數據處理

以各處理殺菌劑質量濃度的對數值為自變量（x），相對應的菌絲生長或孢子萌發抑制率的概率值為因變量（y），作毒力回歸直線得到回歸方程，求出有效抑制中濃度EC50值。

2 結果與分析

2.1 7 種殺菌劑在不同質量濃度下A. alternata 菌絲生長的抑制率

7 種殺菌劑在不同質量濃度下對A.alternata菌絲生長抑制率的影響如表2所示。

表2 7 種殺菌劑在不同質量濃度下對A. alternata 菌絲生長抑制率的影響Tab.2 Effects of 7 fungicides on inhibition rates of mycelial growth of A. alternata at different mass concentrations

研究結果表明，7 種殺菌劑對病原菌菌絲的生長都有不同程度的抑制作用，且抑制率與質量濃度呈正相關（表2）。7 種供試藥劑中抑制作用最差的是甲基硫菌靈，最高質量濃度下抑制率僅為45.5%；其余6 種殺菌劑對病原菌均有較好的抑制效果，其中腈菌唑抑菌效果最好，最高質量濃度下抑制率達82.2%，其次依次為啶酰菌胺和苯醚甲環唑，最高質量濃度下抑制率分別為81.6%和81.4%。

2.2 7 種殺菌劑對A. alternata 菌絲生長室內毒力的影響

研究結果表明，7 種供試殺菌劑對病原菌菌絲生長抑制效果存在差異（表3），EC50值為0.1～1.0 μg/mL 的殺菌劑有5 種，分別為咪鮮胺、苯醚甲環唑、丙環唑、啶酰菌胺、腈菌唑，其對應的EC50值分別為0.19、0.26、0.47、0.67、0.68 μg/mL；EC50值為1～10 μg/mL 的殺菌劑有1 種，為吡唑萘菌胺，其EC50值為1.08 μg/mL；EC50值在100 μg/mL 以上的殺菌劑有1種，為甲基硫菌靈，其EC50值為245.45 μg/mL。結果表明，咪鮮胺和苯醚甲環唑對病原菌菌絲的毒力最強；甲基硫菌靈對菌絲的毒力最弱。

表3 7 種殺菌劑對A. alternata 菌絲生長室內毒力的影響Tab.3 Effects of 7 fungicides on toxicity of mycelial growth of A. alternata

2.3 7 種殺菌劑在不同質量濃度下A. alternata 分生孢子萌發的抑制率

研究結果表明，7 種殺菌劑對病原菌分生孢子的萌發都有不同程度的抑制作用，且抑制率與質量濃度呈正相關（表4）。7 種供試藥劑中抑制作用最差的是甲基硫菌靈，當抑制率為72.3%時，質量濃度已達800 μg/mL；其余6 種殺菌劑對病原菌均有較好的抑制效果，其中吡唑萘菌胺的抑菌效果最好，質量濃度為1 μg/mL 時，抑制率可達76.9%。

表4 7 種殺菌劑在不同質量濃度下對A. alternata 分生孢子萌發抑制率的影響Tab.4 Effects of 7 fungicides on inhibition rates of conidial germination of A. alternate at different mass concentrations

2.4 7 種殺菌劑對A. alternata 分生孢子萌發的室內毒力及其萌發形態的影響

在供試藥劑質量濃度范圍內，分生孢子的萌發率隨不同殺菌劑質量濃度的升高而降低（表5），其中，EC50值為0.1～1.0 μg/mL 的殺菌劑有吡唑萘菌胺和啶酰菌胺，其EC50值分別為0.21、0.29 μg/mL；EC50值為10～100 μg/mL 的殺菌劑有丙環唑和腈菌唑，其EC50值分別為36.63、75.46 μg/mL；EC50值為100～500 μg/mL 的殺菌劑有咪鮮胺和苯醚甲環唑2種；其EC50值分別115.03、207.75 μg/mL；EC50值在500 μg/mL 以上的殺菌劑有甲基硫菌靈1 種，其EC50值為524.69 μg/mL。結果表明，吡唑萘菌胺和啶酰菌胺對病原菌分生孢子的毒力最強，甲基硫菌靈對病原菌分生孢子的毒力最弱。

表5 7 種殺菌劑對A. alternata 分生孢子萌發室內毒力的影響Tab.5 Effects of 7 fungicides on toxicity of conidial germination of A. alternate

不同藥劑對病原菌分生孢子的萌發具有不同影響。在對照培養基上分生孢子從兩端或中間萌發，芽管形態正常，極少產生分枝（圖1-A）。在含咪鮮胺、啶酰菌胺和吡唑萘菌胺3 種藥劑培養基上培養6 h，發現病原菌的分生孢子萌發后芽管頂端膨大且分枝增多（圖1-B、G、H）；在苯醚甲環唑、甲基硫菌靈、腈菌唑和丙環唑4 種含藥培養基上培養6 h，發現分生孢子芽管稍粗大、分枝稍增多（圖1-C～F）。

圖1 7 種不同質量濃度殺菌劑處理病原菌6 h 后分生孢子和芽管的形態Fig.1 Morphology of conidia and germ tubes of the pathogen treated with different mass concentrations of seven fungicides for 6 h

3 結論與討論

多項研究表明，植物病原真菌直接或間接侵入寄主并在寄主內定殖生長是病害發生和擴展的先決條件[16]。菌絲是病原菌侵染的關鍵，DAI 等[17]觀察粉紅單端孢Trichothecium roseum在蘋果上的侵染特性，發現其菌絲通過蘋果花柱縫隙侵入，最終引起果肉中心發病；同樣，分生孢子在病原菌的侵染與傳播過程中也扮演著重要的角色；丁正[18]研究發現，蘋果樹輪紋病病原Botryosphaeria dothidea最先通過分生孢子在蘋果枝條表面萌發進行侵入。因此，研究藥劑對病原菌菌絲和分生孢子的室內毒力能為田間化學藥劑的合理使用提供參考，且對病害的防治具有重要意義。咪鮮胺、苯醚甲環唑、腈菌唑和丙環唑是一類對子囊菌具有較高活性的具有保護和鏟除效果的殺菌劑[19-20]；啶酰菌胺和吡唑萘菌胺是一類抑制真菌孢子萌發和芽管伸長的保護治療性殺菌劑[21]。

本研究藥劑對病原菌的室內毒力測定結果表明，不同殺菌劑對病原菌菌絲生長與分生孢子萌發的抑制效果不同。7 種殺菌劑對病原菌菌絲的毒力大小依次為咪鮮胺＞苯醚甲環唑＞丙環唑＞啶酰菌胺＞腈菌唑＞吡唑萘菌胺＞甲基硫菌靈，研究表明，咪鮮胺、苯醚甲環唑和丙環唑對藜麥鏈格孢葉斑病菌菌絲生長的抑制效果最好，EC50值均在0.50 μg/mL 以下。段慧[9]對內蒙古自治區藜麥葉片上的A.alternata進行室內藥劑毒力測定發現，10%的苯醚甲環唑的EC50為0.27 μg/mL，本研究測得苯醚甲環唑的EC50為0.26 μg/mL，表明不同地區鏈格孢葉斑病菌A.alternata對苯醚甲環唑的室內毒力差異不明顯。

7 種殺菌劑對鏈格孢葉斑病菌分生孢子的毒力大小依次為吡唑萘菌胺＞啶酰菌胺＞丙環唑＞腈菌唑＞咪鮮胺＞苯醚甲環唑＞甲基硫菌靈，研究表明，吡唑萘菌胺和啶酰菌胺對分生孢子萌發的抑制效果最好，EC50值均在0.50 μg/mL 以下，顯著高于其他殺菌劑，此外，這2 種藥劑可以導致病原菌分生孢子畸形萌發。對病原菌菌絲與分生孢子的毒力研究發現，甲基硫菌靈在抑制病原生長方面效果最差。

藥劑對病原菌的室內毒力測定表明，不同藥劑對病原菌的作用機理不同[22]，如吡唑萘菌胺、啶酰菌胺對病原菌的分生孢子萌發具有較好的抑制作用，苯醚甲環唑和咪鮮胺對病原菌的菌絲生長具有較好的抑制作用。因此，在田間防治過程中不同發病階段要針對性用藥。但藥劑毒力測定是藥劑與病原菌直接接觸而產生的效果，而藥劑在田間的防治效果還受到寄主植物、病原菌和所處環境條件的綜合影響，因此，需要衡量其實際防治效果，還需開展進一步田間試驗。