減氮配施有機(jī)肥對(duì)燕麥土壤細(xì)菌群落特征影響與生態(tài)功能預(yù)測

鄭敏娜，鄒璨陽，康佳惠，楊 富

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 高寒區(qū)作物研究所，山西 大同 037008）

燕麥（Avena sativaL.）為1 年生禾本科糧飼兼用型作物，在全球42 個(gè)國家和地區(qū)廣泛栽培，居世界谷物生產(chǎn)第6 位，主要分布于歐洲、亞洲和非洲的溫帶地區(qū)[1]。我國是燕麥的起源地之一，主要分布在華北、西北和西南等地區(qū)。燕麥具有耐貧瘠、耐鹽堿、耐寒、抗旱、抗風(fēng)沙等特點(diǎn)[2-3]，適應(yīng)性廣泛，且栽培措施簡易，在營養(yǎng)價(jià)值、生產(chǎn)性能、利用方式、開發(fā)潛力等方面優(yōu)勢突出，是山西省傳統(tǒng)優(yōu)勢雜糧作物之一，尤其是大同地區(qū)的特色優(yōu)勢雜糧作物，很受市場的青睞，具有很大的發(fā)展空間和利用潛力，在山西區(qū)域經(jīng)濟(jì)建設(shè)中發(fā)揮著重要作用。

施肥是燕麥田間管理中非常重要的措施之一，對(duì)燕麥田生產(chǎn)力的提升和土壤生態(tài)具有重要作用。肥料（包括無機(jī)肥和有機(jī)肥）輸入土壤后，會(huì)對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生巨大影響，合理施用不但可以直接提升作物產(chǎn)量，而且可以改變土壤微生態(tài)，有利于土壤微生物的正向演替；但在實(shí)際生產(chǎn)中，為了追求更高的產(chǎn)量，化肥施用量偏高，有機(jī)肥投入不足，造成土壤質(zhì)量下降等問題，不但造成了土壤資源嚴(yán)重污染，而且會(huì)威脅食品安全[4]。因此，在燕麥生產(chǎn)過程中，探索合理的減氮配施有機(jī)肥比例，將有利于促進(jìn)土壤和生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展，對(duì)晉北地區(qū)燕麥田土壤生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

在土壤生態(tài)系統(tǒng)中，微生物是重要的參與者，其對(duì)土壤養(yǎng)分循環(huán)、能量流動(dòng)和物質(zhì)轉(zhuǎn)化等起到至關(guān)重要的作用[5-9]，是生態(tài)系統(tǒng)健康可持續(xù)發(fā)展的重要保障。在土壤生態(tài)系統(tǒng)中，相同的微生物種群可以行使不同的土壤功能，相同的土壤過程也可由不同微生物種群完成，其種群會(huì)因環(huán)境變更或管理分異產(chǎn)生微生物多樣性及其生態(tài)功能的變化[9]。目前，眾多學(xué)者在施肥與土壤微生物及其生態(tài)系統(tǒng)方面進(jìn)行了大量研究，大多試驗(yàn)結(jié)果都表明，配施一定比例的有機(jī)肥料后土壤微生物量碳、氮、磷和生物活性均有不同程度的提高，具體效果會(huì)因配施比例或施肥種類而有所差異[10-14]。然而，也有研究顯示，長期氮磷肥配施對(duì)土壤微生物生物量的影響不大[15]。

本研究通過田間小區(qū)試驗(yàn)，研究在不同劑量無機(jī)有肥料配施下，燕麥田土壤環(huán)境及其微生物的生態(tài)差異，揭示不同劑量肥料的輸入對(duì)燕麥田土壤生態(tài)功能的影響，優(yōu)選出最佳施肥模式，為晉北地區(qū)燕麥的種植和提質(zhì)增效提供參考意見。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2022 年在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)高寒區(qū)作物研究所毛皂試驗(yàn)基地（N112°34′～114°34′，E39°03′～40°44′）進(jìn)行。該地海拔1 050 m，屬中溫帶干旱區(qū)，土壤有機(jī)質(zhì)含量為12.61 g/kg，土壤全氮含量為0.81 g/kg，土壤有效磷含量為5.03 mg/kg，土壤pH值為8.37。

1.2 試驗(yàn)材料

選用燕麥品種晉燕17 號(hào)為試驗(yàn)材料，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)高寒區(qū)作物研究所提供。試驗(yàn)所用肥料為尿素和自制有機(jī)肥，其中，尿素N 含量≥46%；自制有機(jī)肥以牛糞為主要原料，其有機(jī)質(zhì)含量為15.8%，N 含量為0.046 g/kg。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組排列。播前進(jìn)行精細(xì)耙耱鎮(zhèn)壓，平整后人工開溝條播，小區(qū)面積為10 m2（2 m×5 m），3 次重復(fù)，種植密度為400 萬株/hm2，播種深度3～5 cm，行間距約25 cm。

試驗(yàn)共設(shè)7 個(gè)處理，以不施肥處理為對(duì)照（CK），分別設(shè)置僅施用氮肥（T1）和氮肥與有機(jī)肥分別按照9∶1（T2）、8∶2（T3）、7∶3（T4）、6∶4（T5）和5∶5（T6）的比例配施，共計(jì)21 個(gè)小區(qū)，其中，T1 處理N 的施用量為180 kg/hm2，T2～T6 等5 個(gè)處理N 的總用量與T1 處理一致，對(duì)應(yīng)有機(jī)肥施用量按照配施比例計(jì)算，P、K 施用量各小區(qū)均相同，試驗(yàn)期間各處理田間管理保持一致，具體施用量如表1 所示。

表1 各處理的肥料施用時(shí)期和施用量Tab.1 The fertilizer application period and dosage of each treatment

1.4 測定項(xiàng)目及方法

1.4.1 土壤樣品采集與測定 于燕麥成熟期，各小區(qū)按對(duì)角線5 點(diǎn)采集燕麥根際土壤，采用四分法取0.2 kg 土壤樣品，3 次重復(fù)。取樣后，一部分土樣，風(fēng)干后測定常規(guī)土壤化學(xué)指標(biāo)[16]，包括全氮（TN）、速效氮（AN）、速效磷（AP）、速效鉀（AK）、有機(jī)質(zhì)（OM）；另一部分土樣-80 ℃保存進(jìn)行土壤微生物分析。

1.4.2 籽粒產(chǎn)量測定 于燕麥成熟期，收獲測定各小區(qū)的種子產(chǎn)量。

1.4.3 土壤微生物總DNA 提取及生物信息學(xué)分析 使用MN NucleoSpin 96 Soil（Germany）試劑盒進(jìn)行DNA 的提取，每個(gè)樣品重復(fù)3 次，采用PacBio 測序平臺(tái)的通用引物（正向27F 和反向1492R），以細(xì)菌16SrRNA 基因全長序列（V3-V4）為目的片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系參照艾鋒等[17]，擴(kuò)增合格的樣品在北京百邁克生物有限公司進(jìn)行測序分析，對(duì)得到的高質(zhì)量CCS 序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，具體方法參照艾鋒等[17]文獻(xiàn)。最后，使用PICRUSt 軟件進(jìn)行細(xì)菌功能類群預(yù)測[18]。此外，利用STAMP 和R 軟件進(jìn)行方差分析等。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2009 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 22.0軟件用單因素方差分析不同處理間的差異顯著性（P＜0.05），采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下土壤養(yǎng)分及籽粒產(chǎn)量的變化

不同處理下土壤特性和籽粒產(chǎn)量如表2 所示。

表2 不同處理下土壤特性和籽粒產(chǎn)量比較Tab.2 Comparison of soil characteristics and seed yield under different treatments

由表2 可知，與CK 相比，各處理的土壤全氮（TN）和速效氮（AN）含量均有所增加，但各處理間差異不顯著；對(duì)土壤速效鉀（AK）、速效磷（AP）和有機(jī)質(zhì)（OM）含量則有顯著影響，其中，速效鉀（AK）和速效磷（AP）含量均在T3 處理時(shí)最高，分別為251.14、10.99 mg/kg，與其他處理間差異顯著（除T4處理外，P＜0.05）；隨著施入有機(jī)肥肥量的增加，土壤中有機(jī)質(zhì)的含量逐漸增加，在T6 處理時(shí)達(dá)到最大，為14.86 g/kg，與其他各處理間差異顯著（除T5、T4處理外，P＜0.05）。此外，籽粒產(chǎn)量T4 處理最大，為4 357.61 kg/hm2，與其他處理間差異顯著（P＜0.05）。

2.2 土壤微生物特征的變化

2.2.1 土壤細(xì)菌群落多樣性分析 本研究計(jì)算了減氮配施有機(jī)肥處理下燕麥根際土壤細(xì)菌群落的Alpha 多樣性。豐富度指數(shù)評(píng)估（圖1）發(fā)現(xiàn)，Chao1和ACE 指數(shù)具有相似的變化規(guī)律，表現(xiàn)為T6 處理高于其他處理；多樣性評(píng)估表明，T3 處理Shannon多樣性指數(shù)最高（8.78），與最低的T2 處理間差異顯著（P＜0.05）；T1 處理的Simpson 指數(shù)最高，仍以T2 處理的最低，二者間差異顯著（P＜0.05）。

圖1 不同處理下土壤細(xì)菌群落Alpha 多樣性Fig.1 Alpha diversity of soil bacterial communities under different treatments

采用主坐標(biāo)分析（Principal co-ordinates analysis，PCoA）結(jié)果表明（圖2），T5、T6 處理落在第1 象限，T4 處理落在第1 象限和第4 象限，T3 處理落在第1 象限和第2 象限，T1 和CK 落在第2 象限，而T2 處理則落在第3 象限，與其他處理間無交集產(chǎn)生，且T2 處理與其他6 個(gè)處理間存在顯著差異（P＜0.05）。

圖2 不同處理下土壤細(xì)菌群落的PCA 分析Fig.2 The PCA analysis of soil bacterial communities under different treatments

2.2.2 細(xì)菌群落組成 分析結(jié)果顯示（圖3-A），相對(duì)豐度占比較高的是變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi），它們占細(xì)菌群落相對(duì)豐度的76.6%以上。

圖3 不同處理下細(xì)菌門（A）和屬（B）的組成結(jié)構(gòu)Fig.3 Composition and structure of bacterial phyla（A）and genus（B）under different treatments

圖4 不同處理下環(huán)境因子和土壤細(xì)菌的相對(duì)豐度間的RDA 分析Fig.4 Redundancy analysis（RDA）of environmental factors and relative abundance of soil bacteria under different treatments

在這些占主要優(yōu)勢的門中，CK、T1、T2 這3 個(gè)處理中的優(yōu)勢菌為變形菌門，它的相對(duì)豐度占比最高，分別為44.21%、45.64%和43.93%，且CK、T1、T2 與T3、T4、T5、T6 處理間差異顯著（P＜0.05）；隨著有機(jī)肥施入量的增加，變形菌門的相對(duì)豐度占比出現(xiàn)下降，厚壁菌門成為優(yōu)勢菌，其中，以T4 處理中相對(duì)豐度占比最高，達(dá)到36.12%，與CK、T1和T2 處理間差異顯著（P＜0.05）；擬桿菌門作為第三豐富的優(yōu)勢門，在T2 和T4 處理中相對(duì)豐度較高，分別為23.16%和20.64%，與其他5 個(gè)處理間差異顯著（P＜0.05）；放線菌門在T3 處理中最為豐富（17.53%），但與CK（16.21%）間差異不顯著；綠彎菌門則在T3 處理中相對(duì)占比最高（8.26%），與CK（7.88%）間差異不顯著，與其他5 個(gè)處理間差異顯著（P＜0.05）。

在屬水平（圖3-B）上，已分類的相對(duì)豐度較高的屬（＞1%）有不可培養(yǎng)c-Subgroup-6（unculturedbacterium-c-Subgroup-6）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、不可培養(yǎng)bacterium（uncultured-bacterium）、乳酸菌屬（Lactobacillus）、擬桿菌屬（Bacteroides）等。其中，鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）為第1 優(yōu)勢菌屬，在CK 中相對(duì)豐度占比最豐富（5.42%）；乳酸菌屬（Lactobacillus）和擬桿菌屬（Bacteroides）兩類菌屬則主要分布在T4、T5、T6處理中，相對(duì)豐度顯著優(yōu)于其他4個(gè)處理（P＜0.05）；不可培養(yǎng)c-Subgroup-6（uncultured-bacterium-c-Subgroup-6）則在CK、T1 處理中相對(duì)豐度較高，占比均超過5.20%。

2.2.3 不同處理的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與其環(huán)境因子的關(guān)系 在屬水平上，冗余分析（RDA）結(jié)果表明（圖4），第1 種和第2 種RDA 成分能夠累積解釋細(xì)菌菌群30.11%的變化，且不同環(huán)境因子對(duì)屬水平上細(xì)菌群落的影響有所差異，其中，AN 與Lamia、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)（P=0.004），而與WCHB1-32、假單胞菌屬（Pseudomonas）呈顯著負(fù)相關(guān)（P=0.003）；OM、AK、TN與紅球菌屬（Rhodococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、巨單胞菌屬（Megamonas）、乳酸菌屬（Lactobacillus）相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)（P=0.003），亦與WCHB1-32 呈顯著負(fù)相關(guān)（P=0.004）。

2.3 土壤細(xì)菌PICRUSt 基因功能預(yù)測

為了解減氮配施有機(jī)肥處理下沙壤土細(xì)菌代謝功能，使用PICRUSt 軟件比對(duì)測序數(shù)據(jù)獲得的物種組成信息，進(jìn)行功能基因預(yù)測（圖5-A），經(jīng)與KEGG 數(shù)據(jù)庫比對(duì)發(fā)現(xiàn)，不同肥料處理下的土壤菌群基因序列，在一級(jí)功能代謝通路下注釋到的功能主要分為新陳代謝（Metabolism）、環(huán)境信息處理（Environment information processing）、遺傳信息處理（Genetic information processing）、細(xì)胞轉(zhuǎn)化（Cellular processes）、人類疾病（Human diseases）和生物體系統(tǒng)（Organismal systems）等6 類，其余為PICRUSt 目前無法鑒定的細(xì)菌類群。與不施肥處理（CK）相比，細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能基因的豐度表現(xiàn)為T3、T4、T5、T6 處理有顯著降低的趨勢，而遺傳信息處理和生物體系統(tǒng)功能基因的豐度表現(xiàn)為T4、T5、T6 處理有顯著增加的趨勢，但新陳代謝、環(huán)境信息處理和人類疾病功能基因的豐度在各處理間無顯著差異。

圖5 不同施肥處理下土壤細(xì)菌功能基因KEGG 豐度（一級(jí)功能層（A）和二級(jí)功能層（B））Fig.5 KEGG abundance of soil bacterial functional genes under different fertilization treatments（primary functional layer（A） and secondary functional layer（B））

在二級(jí)功能預(yù)測中（圖5-B），不同肥料處理下的土壤菌群差異基因主要集中在10 個(gè)通路中，其中，全局和概覽通路（Global and overiew maps，41.17%～43.51%）、碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism，8.26%～9.71%）、氨基酸代謝（Amino acid metabolism，6.27%～8.01%）、能量代謝（Energy metabolism，3.95%～5.88%）、輔助因子和維生素代謝（Metabolism of cofactors and vitamins，3.37%～5.09%）為主要子功能。與不施肥處理（CK）相比，各處理的氨基酸代謝和輔因子和維生素代謝功能基因顯著增加（除TI、T2 外，P＜0.05），氨基酸代謝功能顯著降低（除T2 外，P＜0.05），而其他功能基因未有顯著差異。

3 結(jié)論與討論

在燕麥生產(chǎn)中，施肥是向農(nóng)田系統(tǒng)輸入養(yǎng)分元素的最主要途徑，也是人為調(diào)控、管理養(yǎng)分不可替代的技術(shù)手段。但傳統(tǒng)的燕麥田施肥是以作物高產(chǎn)為唯一目標(biāo)，年復(fù)一年投入大量的化學(xué)肥料，不但造成營養(yǎng)元素利用率較低，而且還引起土壤有機(jī)質(zhì)含量減少、土壤污染等問題。因此，科學(xué)、合理的肥料配施（有機(jī)肥和無機(jī)肥）有助于燕麥田養(yǎng)分高效利用。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著施入有機(jī)肥肥量的增加，有機(jī)質(zhì)含量明顯增加，與劉佳遙等[18]、商麗榮等[19]、XU 等[20]的研究結(jié)果基本一致。此外，T4 處理下籽粒產(chǎn)量達(dá)到最大，這也說明在該處理下不但可以保證燕麥正常生長發(fā)育所需的氮素，而且對(duì)土壤生態(tài)最有利。

土壤生態(tài)系統(tǒng)中所有的微生物種類以及它們與環(huán)境之間相互作用的多樣化程度被稱為土壤微生物多樣性[9]，包括了物種多樣性、功能多樣性、結(jié)構(gòu)多樣性及遺傳多樣性等不同層面[8]。其中，土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物的物種豐富度和均一度，是微生物多樣性的最直接表現(xiàn)形式[21]。本研究表明，Chao1 和ACE 指數(shù)表現(xiàn)為T6 處理最高，與T4、T5處理間差異不顯著。此外，肥料措施作為對(duì)土壤擾動(dòng)的一種重要方式，也將會(huì)給微生物群落結(jié)構(gòu)和成分帶來顯著的影響[4,17]。在本研究中，變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、放線菌門（Actinobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi）等5 個(gè)菌門最具優(yōu)勢，它們占細(xì)菌群落相對(duì)豐度的76.6%以上，這與前人的研究基本一致[22-24]。而且不同減氮配施比例引起的土壤環(huán)境因子變化對(duì)不同微生物群體的影響各不相同[17]。本試驗(yàn)RDA 分析結(jié)果表明，AN、OM、AK、TN 對(duì)處理中的細(xì)菌群落有著更為顯著的影響作用，例如，OM、AK、TN 與紅球菌屬（Rhodococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、巨單胞菌屬（Megamonas）、乳酸菌屬（Lactobacillus）相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)。

PICRUSt 功能預(yù)測表明，燕麥田減氮配施有機(jī)肥后土壤細(xì)菌群落的主要功能是新陳代謝，表明代謝是細(xì)菌群落主要的核心功能，同時(shí)具有環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、人類疾病和生物體系統(tǒng)等5 個(gè)功能，其中，減氮增施有機(jī)肥提高了遺傳信息處理和生物體系統(tǒng)功能基因豐度，這可能是由于有機(jī)肥添加顯著富集了與碳循環(huán)相關(guān)功能基因，有助于提升有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化及碳源的利用率，后續(xù)將結(jié)合宏基因組學(xué)測序進(jìn)一步分析燕麥田減氮配施有機(jī)肥后土壤細(xì)菌的群落功能。

綜上所述，減氮配施有機(jī)肥處理下，隨著有機(jī)肥比例的增加，土壤中有機(jī)質(zhì)的含量逐漸增加，在T6 處理時(shí)達(dá)到最大，籽粒產(chǎn)量在T4 處理下達(dá)到最大。與不施有機(jī)肥土壤相比，增施有機(jī)肥后顯著提升了變形菌門、厚壁菌門的相對(duì)豐度。并且減氮配施有機(jī)肥后明顯降低了土壤細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能基因的豐度，明顯增加了生物體系統(tǒng)功能基因的豐度。