左旋含羞草堿對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其機制研究

劉超柱, 胡偉林

(1. 武漢科技大學附屬武昌醫院 呼吸與危重癥醫學科, 湖北 武漢, 430000;2. 武漢科技大學 醫學院, 湖北 武漢, 430000)

肺癌是威脅人類生命安全的惡性腫瘤之一,其發病率與致死率均增長較快。目前,肺癌的聯合治療技術已取得巨大進步,但患者預后仍很差, 5年生存率較低[1-2]。中醫藥是肺癌患者良好的輔助治療藥物,治療效果良好,且毒性較小[3-4]。左旋含羞草堿是從含羞草中提取的一種植物氨基酸,可抑制咽鱗狀細胞癌細胞生長[5]。然而,左旋含羞草堿能否調控肺癌的發生與發展尚未明確。微小RNA(miRNA)約有22個核苷酸,主要通過對靶基因的翻譯抑制及mRNA降解參與疾病的進展過程。研究[6]表明,微小RNA-1301-3p(miR-1301-3p)在肺癌組織和細胞中表達增加,下調miR-1301-3p能夠抑制肺癌細胞生長及遷移。本研究探討左旋含羞草堿對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其可能作用機制,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人正常肺上皮細胞BEAS-2B、人肺癌細胞A549均購自美國模式培養物集存庫(ATCC); DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜、磷酸鹽緩沖液、多聚甲醛、結晶紫、噻唑藍(MTT)均由上海碧云天生物提供; Nanodrop2000c超微量分光光度計、細胞裂解液、實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑、96孔反轉錄儀器和96孔qRT-PCR儀器購自美國Thermo Fisher公司; 寡聚核苷酸包括anti-miR-NC、miR-1301-3p抑制劑、miR-NC、miR-1301-3p模擬物均由廣州銳博生物合成; Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司; Transwell試驗所用的小室以及Matrigel基質膠購自美國Corning公司; 一抗抗體和二抗抗體由美國Santa Cruz公司提供。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組: 將A549細胞以4 000個/孔的密度培養于直徑9.6 cm的有蓋培養皿,隨后向孔中加入含不同濃度(100、200、400 μmol/L)左旋含羞草堿的DMEM培養基培養24 h[7], 分別記為左旋含羞草堿低劑量組、左旋含羞草堿中劑量組、左旋含羞草堿高劑量組,另將正常培養的A549細胞記為對照組。為探討miR-1301-3p對肺癌細胞生物學行為的影響,本研究采用脂質體轉染法將miR-1301-3p抑制劑及其對照分別轉染至培養的A549細胞,分別記為anti-miR-1301-3p組、anti-miR-NC組。為驗證左旋含羞草堿是否可通過調控miR-1301-3p表達而影響肺癌細胞生物學行為,本研究采用脂質體轉染法將miR-1301-3p模擬物及其對照分別轉染至A549細胞,轉染成功后將400 μmol/L左旋含羞草堿添加到每組并培養24 h, 分別記為左旋含羞草堿+miR-1301-3p組、左旋含羞草堿+miR-NC組。

1.2.2 MTT試驗: 一系列處理后,收集各組A549細胞以2 000個/孔的密度培養于96孔板。根據MTT試劑盒的說明書,向培養皿每孔中加入5 mg/mL MTT試劑20 μL, 并在培養箱中孵育4 h。向每孔加入150 μL 二甲基亞砜,以溶解細胞中的甲瓚。隨后,使用酶標儀檢測樣品在490 nm處的吸光度(A)值。最后,根據所測A值計算細胞增殖抑制率,公式為(對照組A-實驗組A)/(對照組A-空白組A)×100%。

1.2.3 平板克隆形成實驗: 不同處理后,收集各組A549細胞以200個/孔的密度培養于12孔板,于5%二氧化碳的培養箱中培養14 d, 培養期間每3 d更換1次DMEM培養基。各組A549細胞用磷酸鹽緩沖液洗之后,每孔加入多聚甲醛和1%結晶紫。觀察細胞集落形成情況,計數細胞克隆形成數,單個集落的判斷標準是細胞團直徑大于1 mm, 當集落之間出現相互融合時結束計數。

1.2.4 劃痕實驗: 鋪板之前先用馬克筆在6孔板背面筆直地畫3條橫線作為標記,經不同處理后,收集各組A549細胞以2×105個/孔的密度培養于6孔板,放置于5%二氧化碳的培養箱中培養至細胞長滿。用20 μL槍頭垂直于孔板背面的橫線畫1條筆直的道痕,以磷酸鹽緩沖液洗滌,將此時作為起始時刻,拍照后將培養板放入培養箱內繼續培養24 h后拍照。應用ImageJ軟件計算細胞劃痕愈合率,公式為(劃痕起始寬度-劃痕端點寬度)/劃痕起始寬度×100%。

1.2.5 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力: 于Transwell小室提前鋪上Matrigel基質膠。不同處理后,收集各組細胞并以1×105個/孔的密度鋪在小室的上室,培養48 h,同時在下室加入含10%胎牛血清的培養液作為化學引誘物。用磷酸鹽緩沖液洗滌后,向每孔中加入多聚甲醛和1%結晶紫,最后于顯微鏡下統計侵襲細胞數。

1.2.6 qRT-PCR: 依據Trizol試劑說明書提取細胞RNA,使用微量核酸蛋白分析儀分析RNA濃度,以A260 nm與A280 nm比值(A260/A280)分析RNA純度,RNA完整性通過將RNA樣品在2%瓊脂糖凝膠中電泳進行分析, miRNA反轉錄盒子用于RNA反轉錄。將SYBR Green試劑10 μL、上游引物0.6 μL、下游引物0.6 μL、模板2 μL、雙蒸水6.8 μL混合后,按照95 ℃預變性2 min, 95 ℃變性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共40個循環的反應條件,在儀器上進行qRT-PCR。以U6為內參,采用2-△△Ct法計算miR-1301-3p相對表達量。

1.2.7 蛋白質印跡法(Western blot): 依據RIPA裂解液說明書提取細胞蛋白,將部分蛋白樣品與上樣緩沖液混合均勻以100 ℃水煮12 min。使用Nanodrop2000c超微量分光光度計分析剩余一部分蛋白樣品濃度。根據測定的蛋白濃度計算40 μg蛋白所需體積,隨后按照40 μg蛋白的量對樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE), 5%脫脂牛奶封閉膜2 h, 分別加入E-cadherin(1∶800)、N-cadherin(1∶800)和GAPDH(1∶2 000)一抗抗體稀釋液,再加入二抗稀釋液(1∶3 000), 滴加eyoECL Plus, 暗室內曝光顯影。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 左旋含羞草堿對肺癌A549細胞增殖的影響

與對照組比較,左旋含羞草堿低劑量組、中劑量組、高劑量組的肺癌A549細胞增殖抑制率均升高,細胞克隆形成數均減少,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 不同劑量左旋含羞草堿對肺癌A549細胞克隆能力的影響

表1 不同劑量左旋含羞草堿對肺癌A549細胞增殖的影響

2.2 左旋含羞草堿對肺癌A549細胞遷移、侵襲的影響

與對照組比較,左旋含羞草堿低劑量組、中劑量組、高劑量組的肺癌A549細胞的劃痕愈合率、N-cadherin蛋白水平和侵襲細胞數均降低, E-cadherin蛋白水平均升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 不同劑量左旋含羞草堿對肺癌A549細胞遷移、侵襲相關蛋白表達的影響

表2 不同劑量左旋含羞草堿對肺癌A549細胞遷移、侵襲能力的影響

2.3 miR-1301-3p在BEAS-2B細胞和肺癌A549細胞中的表達

A549細胞的miR-1301-3p表達量為(3.59±0.28), 高于BEAS-2B細胞的(1.00±0), 差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 左旋含羞草堿對肺癌A549細胞miR-1301-3p表達的影響

左旋含羞草堿低劑量組、左旋含羞草堿中劑量組、左旋含羞草堿高劑量組的miR-1301-3p表達量均高于對照組,且劑量越高, miR-1301-3p表達量越低,差異有統計學意義(P<0.05), 見表3。

表3 不同劑量左旋含羞草堿對肺癌A549細胞miR-1301-3p表達的影響

2.5 下調miR-1301-3p對肺癌A549細胞增殖、遷移、侵襲的影響

與anti-miR-NC組比較, anti-miR-1301-3p組的細胞增殖抑制率、E-cadherin蛋白表達升高, miR-1301-3p表達、細胞克隆形成數、侵襲細胞數、劃痕愈合率和N-cadherin蛋白表達降低,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖3、表4。

圖3 干擾miR-1301-3p表達對肺癌A549細胞遷移、侵襲相關蛋白表達的影響

表4 干擾miR-1301-3p對肺癌A549細胞增殖、遷移、侵襲的影響

2.6 miR-1301-3p過表達可逆轉左旋含羞草堿(400 μmol/L)對肺癌A549細胞增殖、遷移、侵襲的作用

與左旋含羞草堿+miR-NC組相比,左旋含羞草堿+miR-1301-3p組的細胞增殖抑制率、E-cadherin蛋白表達降低, miR-1301-3p表達、細胞克隆形成數、侵襲細胞數、劃痕愈合率和N-cadherin蛋白表達升高,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖4、表5。

圖4 miR-1301-3p過表達逆轉了左旋含羞草堿對肺癌A549細胞遷移、侵襲相關蛋白表達的作用

表5 miR-1301-3p過表達逆轉左旋含羞草堿對肺癌A549細胞的調控作用

3 討 論

中醫藥具有抗炎、抗氧化應激與抗腫瘤等功效,可用于減緩肺癌發展進程,其作用機制與調控與左旋含羞草堿+miR-NC組比較, *P<0.05。

多種基因或多條信號通路表達有關[8]。miRNA可通過靶向結合靶基因而抑制其表達或翻譯,進而調控肺癌細胞生物學行為,相關研究[9-10]已證實miRNA具有作為肺癌診斷及預后生物學標志物的潛力。

左旋含羞草堿可抑制人頭頸鱗狀細胞癌細胞增殖,并誘導細胞凋亡[11]。研究[12]報道,左旋含羞草堿可通過介導caspase-9表達而促進骨肉瘤細胞凋亡。目前,左旋含羞草堿與肺癌相關性的研究尚極少見,本研究發現左旋含羞草堿可抑制肺癌細胞增殖。上皮-間充質轉化(EMT)是一種有助于癌細胞轉移的進程,在此轉化過程中,癌細胞能同時具有間質性和上皮性特征,另外還涉及N-cadherin表達上調和E-cadherin下調[13-14]。本研究結果顯示,左旋含羞草堿能夠降低肺癌細胞中N-cadherin蛋白水平和細胞侵襲能力,并增加E-cadherin表達,表明左旋含羞草堿能夠抑制肺癌細胞遷移及侵襲,這可能與其能抑制EMT有關。

研究[15]顯示, miR-1301-3p能促進胃癌細胞增殖和克隆形成。miR-1301-3p在非小細胞肺癌組織和細胞中表達水平升高,并可通過靶向調控Thy-1表達而促進非小細胞肺癌發展,或可作為評估患者預后的潛在生物學標志物[16]。本研究結果顯示,肺癌細胞中miR-1301-3p表達量升高,而左旋含羞草堿可抑制肺癌細胞中的miR-1301-3p表達。本研究還發現,下調miR-1301-3p能夠抑制肺癌細胞增殖、遷移和侵襲,而miR-1301-3p過表達可逆轉左旋含羞草堿對肺癌細胞惡性表型的抑制作用。由此提示,左旋含羞草堿可通過下調miR-1301-3p表達而抑制肺癌細胞增殖、遷移及侵襲。

綜上所述,左旋含羞草堿通過下調miR-1301-3p表達而抑制肺癌細胞增殖、侵襲和遷移能力,或可成為治療肺癌的新型藥物。但本研究未探討miR-1301-3p調控肺癌進程的具體機制,未來還需進一步深入研究。