安羅替尼聯合抗程序性死亡受體-1抑制劑抑制肺腺癌的可能機制探討

周澤軍, 謝海燕, 張 宇, 石 文, 夏 寧

(南京腦科醫院胸科院區/原南京市胸科醫院 呼吸一科, 江蘇 南京, 210029)

抗程序性死亡-配體1(PD-L1)的免疫治療在非小細胞肺癌中取得了一系列突破性進展,已有多種藥物獲批臨床適應證[1-4]。然而,并不是所有患者都能從抗PD-L1的免疫治療中獲益。研究[5-6]表明,血管內皮生長因子(VEGF)及血管內皮生長因子受體(VEGFR)介導的腫瘤血管新生在腫瘤免疫逃避中發揮重要作用,而抗VEGF或VEGFR的藥物聯合抗PD-L1的藥物也取得了更好的抗腫瘤效果[7]。作為一個多靶點的激酶抑制劑,安羅替尼的靶點包括VEGFR、血小板衍生生長因子(PDGFR)、成纖維細胞生長因子受體(FGFR)和原癌基因(c-Kit)等,具有抗腫瘤血管生成和抑制腫瘤生長的雙重作用[8-9]。本研究探討安羅替尼是否能夠提高程序性死亡受體-1(PD-1)單抗的療效,現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般材料

LLC細胞系購自上海中科院細胞庫,采用RPMI1640培養基+10%胎牛血清培養; 靶向c-Kit的siRNA購自美國Santa Cruz公司,貨號sc-29852; siRNA轉染相關試劑購自美國Santa Cruz公司; 6周齡雌性C57小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,體質量18～22 g, 無特定病原體(SPF)級,動物合格證號為SCXK(京)2006-0009; 安羅替尼,規格為10 mg/粒,國藥準字H20180003, 正大天晴藥業集團股份有限公司; 抗PD-1單抗購自美國BioXcell公司; 凝膠電泳儀、垂直電泳槽及凝膠成像系統均購自美國Bio-rad公司; 微量紫外可見光分光光度計購自瑞士梅特勒托利多; 細胞裂解液P0013購自碧云天生物; 抗c-Kit、Wnt1 β-catenin、γ干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、PD-L1、c-Myc、c-Jun、GAPDH一抗抗體均購自Cell Signaling Technology; 抗兔、鼠二抗購自美國Affinity公司; Lipofectamine?2000購自美國Invitrogen公司。

1.2 肺癌荷瘤小鼠模型制備及給藥

將LLC細胞重懸于磷酸鹽緩沖液(PBS), 濃度調整為5×105個/L, 皮下種瘤,接種體積100 μL/只,接種7 d, 肉眼可見接種處有明顯的鼓包,提示肺癌荷瘤小鼠制備成功。將制備成功的肺癌小鼠模型隨機分為4組,即陰性對照組、安羅替尼組、抗PD-1單抗組、安羅替尼聯合抗PD-1單抗組,每組8只。陰性對照組給予灌胃生理鹽水,安羅替尼組給予灌胃安羅替尼(劑量為每100 g 16 μg, 1次/d), 抗PD-1單抗組腹腔內注射抗PD-1單抗(劑量為每次按100 g 1 mg, 每3 d注射1次),安羅替尼聯合抗PD-1單抗組給予灌胃安羅替尼(劑量為每次100 g 16 μg, 1次/d)和腹腔內注射抗PD-1單抗(劑量為每次按100 g 1 mg, 每3 d注射1次)。所有組別連續治療25 d。

1.3 指標檢測

采用游標卡尺測量各組小鼠接種處的腫瘤直徑,并計算腫瘤體積,測量時點為給藥0、5、10、15、20、25 d。

1.4 生物信息學分析

基因富集分析(GSEA)在Java 環境下的GSEA 桌面應用中進行(GSEA v4.0.1, http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)。22種免疫細胞浸潤分析在CIBERSORTx官網的在線工具(https://cibersortx.stanford.edu/)中進行。相關性分析的數據來自腫瘤與癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫中肺腺癌(LUAD)隊列。

1.5 Western Blot實驗

在轉染前1 d, 將對數生長期的LLC細胞從培養皿中消化、重懸,細胞計數后按每孔 1×106個細胞接種于6孔板中,在培養基中培養過夜,待6孔板細胞密度達到約70%時,根據Lipofectamine 2000說明書轉染。轉染48 h后分組,其中對照組為正常LLC細胞, si-c-Kit組為siRNA敲低c-Kit表達,安羅替尼處理組為安羅替尼處理LLC細胞。提取各組細胞總蛋白,采用細胞裂解液裂解,待細胞完全裂解后置于離心機中離心,收集上清液于EP管中,采用BCA蛋白檢測試劑盒測定細胞總蛋白濃度。蛋白變性處理,進行SDS-PAGE電泳。蛋白電泳分離后轉膠至PVDF膜上,脫脂牛奶封閉。加入一抗c-Kit、Wnt1、β-catenin、IFN-γ、TNF-α、PD-L1、c-Myc、c-Jun、GAPDH單克隆抗體,工作濃度均為1∶1 000, 4 ℃孵育過夜,將HRP標記的二抗加入到溶液中,繼續孵育2 h, 曝光成像。GAPDH為內參。

1.6 統計學分析

2 結 果

2.1 安羅替尼聯合PD-1單抗對肺癌小鼠腫瘤體積的影響

與陰性對照組比較,安羅替尼組、PD-1單抗組、安羅替尼聯合PD-1單抗組均可抑制腫瘤的生長,差異有統計學意義(P<0.05); 與安羅替尼組、PD-1單抗組比較,安羅替尼聯合PD-1單抗可抑制腫瘤的生長,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

A: 各組肺癌小鼠腫瘤體積比較; B: 各組肺癌小鼠腫瘤體積的變化圖。 圖1 各組肺癌小鼠腫瘤體積的變化

2.2 c-Kit和VEGFR的GSEA

GSEA結果表明, c-Kit低表達樣本IFN-γ通路富集,差異有統計學意義(P<0.05)(圖2A), c-Kit高表達樣本Wnt/β-catenin通路富集,差異有統計學意義(P<0.05)(圖2B),提示安羅替尼抑制c-Kit可能通過調節IFN-γ通路和Wnt/β-catenin通路提高了PD-1單抗抑制肺癌小鼠腫瘤體積的療效。VEGFR高表達的樣本腫瘤血管生成通路和IL-6/JAK/STAT3通路富集,差異有統計學意義(P<0.05)(圖2C、2D), 提示安羅替尼抑制VEGFR可能通過抑制血管生成和IL-6/JAK/STAT3通路提高了PD-1單抗抑制肺癌小鼠腫瘤體積的療效。

A: c-Kit低表達樣本IFN-γ通路富集; B: c-Kit高表達樣本Wnt/β-catenin通路富集; C: VEGFR高表達的樣本腫瘤血管生成通路富集; D: VEGFR高表達的樣本IL-6/JAK/STAT3通路富集。圖2 c-Kit和VEGFR的GSEA

2.3 c-Kit和VEGFR對腫瘤淋巴細胞浸潤的影響

本研究分析了c-Kit和VEGFR對腫瘤組織中淋巴細胞浸潤的影響。通過CIBERSORTx, 計算TCGA數據庫中LUAD隊列的不同c-Kit和VEGFR表達的樣本中22種淋巴細胞的浸潤比例,結果顯示(圖3), 相較于c-Kit高表達(高于或等于表達中位數), c-Kit低表達(低于表達中位數)樣本中有更多的M1型巨噬細胞、M0型巨噬細胞、活化的NK細胞及更少的剩余記憶性CD4 T細胞、漿細胞和Na?ve B細胞,差異均有統計學意義(P<0.05)。相較于VEGFR高表達(高于或等于表達中位數),VEGFR低表達(低于表達中位數)樣本中有更多的活化的NK細胞、濾泡輔助性T細胞、活化的記憶性CD4 T細胞、CD8 T細胞及更少的M2型巨噬細胞、剩余未活化的NK細胞、記憶性B細胞,差異均有統計學意義(P<0.05)。c-Kit和VEGFR低表達均伴隨著更多的抗腫瘤免疫細胞, c-Kit和VEGFR高表達則伴隨著更多的免疫抑制細胞。

圖3 c-Kit和VEGFR對腫瘤淋巴細胞浸潤的影響

在TCGA數據庫的LUAD隊列中, c-Kit與顆粒酶A(GZMA)、顆粒酶 B(GZMB)、IFN-γ等促免疫分子呈負相關(r<0,P<0.05)(圖4A、4B、4C), 與CD274(PD-L1)、轉化生長因子β(TGF-β)、T細胞免疫球蛋白結構域和粘蛋白結構域-3(TIM3)等免疫抑制分子呈正相關(r>0,P<0.05)(圖4D、4E、4F)。

A: c-Kit與GZMA的相關性; B: c-Kit與GZMB的相關性; C: c-Kit與IFN-γ的相關性; D: c-Kit與CD274的相關性; E: c-Kit與TGF-β的相關性; F: c-Kit與TIM3的相關性。圖4 c-Kit與免疫分子的相關性

VEGFR與GZMA、TNF-α、GZMB、IFN-γ等免疫促進分子均呈負相關(r<0,P<0.05) (圖5A、5B、5C、5D), 與CD274(即PD-L1)、TIM3、PD-1、低氧誘導因子-1A(HIF1A)、淋巴細胞激活基因-3 (LAG3)、TGF-β、細胞毒T淋巴細胞相關抗原4 (CTLA4)等免疫抑制分子均呈正相關(r>0,P<0.05)(圖5E、5F、5G、5H、5K)。上述結果表明,安羅替尼抑制c-Kit和VEGFR, 有可能抑制相關免疫抑制分子,促進免疫促進分子的表達。

A: VEGFR與GZMA的相關性; B: VEGFR與TNF-α的相關性; C: VEGFR與GZMB的相關性; D: VEGFR與IFN-γ的相關性; E: VEGFR與CD274的相關性; F: VEGFR與TIM3的相關性; G: VEGFR與PD-1的相關性; H: VEGFR與HIF1A的相關性; I: VEGFR與LAG3的相關性; J: VEGFR與TGF-β的相關性; K: VEGFR與CTLA4的相關性。圖5 VEGFR與免疫分子的相關性

2.4 安羅替尼通過抑制Wnt/β-catenin通路促進腫瘤免疫

c-Kit對于免疫微環境的調控作用尚不明確,在LLC細胞系中用siRNA敲低c-Kit表達,并與安羅替尼處理后的細胞進行對比。基于圖2中的GSEA結果,分析c-Kit對Wnt/β-catenin通路及相關免疫分子表達的影響。Western Blot實驗證實,采用siRNA抑制c-Kit可降低Wnt1和β-catenin的表達, Wnt/β-catenin通路的下游分子c-Myc、c-Jun的表達也受到抑制, IFN-γ和TNF-α等抗腫瘤免疫的表達則升高, PD-L1的表達降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。采用安羅替尼處理細胞的結果與采用siRNA 敲低c-Kit表達的結果類似,但安羅替尼不改變c-Kit表達,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖6。

圖6 安羅替尼通過抑制Wnt/β-catenin通路促進腫瘤免疫

3 討 論

雖然抗PD-L1的免疫檢查點抑制劑在非小細胞肺癌中取得了突破性進展[1, 4, 10], 但仍有相當一部分患者不能從中獲益或者獲益較少。研究[7]表明,抗PD-L1的免疫檢查點抑制劑阿替利珠單抗聯合含鉑雙藥后,再聯合抗血管生成的藥物貝伐珠單抗,可以進一步提高非鱗非小細胞肺癌患者的療效,延長了無進展生存期,為抗PD-L1的免疫檢查點抑制劑聯合其他靶向藥物提供了新的實例。

作為一個靶向VEGFR、PDGFR、FGFR和c-Kit等多靶點的抑制劑,安羅替尼具有抗腫瘤血管生成和抑制腫瘤的雙重作用[8-9]。本研究通過LLC細胞荷瘤小鼠實驗證實,與安羅替尼組、PD-1單抗組相比,安羅替尼聯合PD-1單抗連續給藥25 d可顯著抑制腫瘤的生長,差異有統計學意義(P<0.05)。基于TCGA數據庫中LUAD隊列的生物信息學分析表明, c-Kit和VEGFR與免疫抑制通路、免疫抑制細胞的浸潤及免疫相關分子的表達均存在線性關系。Western Blot實驗亦表明,安羅替尼或敲低c-Kit表達均可以抑制LLC細胞的Wnt/β-catenin通路,并促進IFN-γ、TNF-α的表達,抑制PD-L1的表達,該結果印證了LUAD隊列的生物信息學分析結果,即安羅替尼通過靶向c-Kit抑制Wnt/β-catenin通路調節免疫微環境,促進抗腫瘤免疫細胞浸潤,提高了抗PD-1單抗抑制腫瘤生長的療效。

本研究不足之處: 本研究僅進行了生物信息學預測與Western Blot實驗,未能從機制方面說明安羅替尼通過抑制VEGFR/c-Kit調控Wnt/β-catenin通路在肺腺癌中的調控及安羅替尼通過抑制Wnt/β-catenin通路促進腫瘤免疫,因此有后續研究有必要增加靶向細胞轉染相關的研究進行驗證。

綜上所述,安羅替尼聯合抗PD-1藥物可以更好地抑制腫瘤生長,其可能機制是安羅替尼通過靶向c-Kit抑制Wnt/β-catenin通路調節免疫微環境,促進抗腫瘤免疫細胞浸潤,有助于提高抗PD-1單抗抑制腫瘤生長的療效。