沉默調節蛋白1對脂多糖誘導大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷的影響

陽 芳, 高 楓, 覃超群, 唐艷萍, 秦會平

(廣西壯族自治區桂林市人民醫院 呼吸與危重癥醫學科, 廣西 桂林, 541001)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是臨床上常見的慢性呼吸系統疾病,在中老年群體中發病率較高[1]。COPD的發病原因與顆粒物、化學物質的吸入引發的慢性炎癥密切相關,而細菌感染則是COPD急性加重的重要誘因[2]。Ⅱ型肺泡上皮細胞(AEC2)是肺遠端結構的關鍵組成細胞,參與肺泡上皮的修復和再生,在COPD疾病進展過程中, AEC2細胞受損,并通過分泌多種細胞炎癥因子參與炎癥反應,但AEC2細胞炎性損傷的調控機制仍不清楚[3-5]。沉默調節蛋白1(SIRT1)是NAD+依賴的組蛋白去乙酰化酶成員,參與細胞氧化應激和細胞凋亡的調控[6]。研究[7-8]發現SIRT1在肺纖維化進展中發揮了重要作用,但SIRT1是否參與細菌感染等引發的AEC2細胞的炎性損傷的調控仍不清楚。本研究通過分離大鼠AEC2細胞,建立體外脂多糖(LPS)誘導的AEC2損傷模型,觀察SIRT1在AEC2細胞炎性損傷中的表達水平的變化及敲低SIRT1對AEC2細胞損傷的影響,探討SIRT1在調控AEC2炎性損傷中的作用及機制,現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

健康清潔級SD大鼠購自北京維通利華公司; IMDM培養基、胎牛血清(FBS)、Trizol試劑購自美國賽默飛世爾科技公司; SIRT1 shRNA慢病毒購自維真生物科技公司; CCK-8細胞活力試劑盒購自日本同仁化學公司; JC-1線粒體膜電位檢測探針、丙二醛(MDA)檢測試劑盒、總超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技公司; 逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR Mix購自南京諾唯贊生物科技公司; 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)酶聯免疫吸附實驗試劑盒購自美國eBioscience公司; LPS購自德國Merck公司; 兔抗SIRT1抗體、兔抗GAPDH抗體和HRP山羊抗兔IgG二抗購自美國CST公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠AEC2細胞分離及培養: 大鼠原代AEC2細胞分離參考文獻[9]。健康雄性SD大鼠10只,經腹腔注射3%戊巴比妥鈉(3 mg/kg)及肝素(400 U/kg), 而后經肺動脈灌洗肺,取出肺組織,用剪刀剪碎后加入含胰蛋白酶的消化液中, 37 ℃震蕩20 min。細胞懸液加入含10% FBS的IMDM完全培養基終止消化,并加入預先包被IgG的培養皿中孵育1 h, 而后取出未貼壁的細胞,經離心后加入IMDM完全培養基重懸,并放置在37 ℃、5%CO2的培養箱中貼壁培養,獲得AEC2細胞。將ACE2細胞分為3組,對照組為正常培養的AEC2細胞,模型組和實驗組分別用空白和SIRT1 shRNA慢病毒感染24 h后,再加入終濃度10 μg/mL LPS處理24 h, SIRT1 shRNA靶向序列為: 5′-GAAGTGCCTCAGATATTAA-3′。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測SIRT1、TNF-α、IL-1β表達: 經胰酶消化、離心收集AEC2細胞,經Trizol裂解后,加入200 μL氯仿,經12 000 g離心10 min, 取上清加入等體積異丙醇。充分混勻后, 12 000 g離心10 min, 采用70%乙醇漂洗RNA沉淀2次,用無核酸酶ddH2O溶解RNA。取1 μg總RNA, 用逆轉錄試劑盒得到cDNA,方法參考產品說明書。以cDNA為模板,用實時熒光定量PCR試劑擴增SIRT1、TNF-α和IL-1β, 以β-actin為內參。所需引物序列為:SIRT1-F為5′-ATCTGACTTTGCTCCCCTTAACC-3′,SIRT1-R為5′-GGGCCCTGGTTGCAAGA-3′;TNF-α-F為5′-GTCGTAGCAAACCACCAAGC-3′,TNF-α-R為5′-TGTGGGTGAGGAGCACATAG-3′;IL-1β-F為5′-CCAGGATGAGGACCCAAGCA-3′,IL-1β-R為5′-TCCCGACCATTGCTGTTTCC-3′;β-actin-F為TCCTTCCTGGGCATGGAGT;β-actin-R為5′-ACTGTGTTGGCGTACAGGTC-3′。

1.2.3 Western blot檢測SIRT1表達: 各組細胞經RIPA細胞裂解液冰上裂解30 min, 12 000 g離心10 min, 取上清加入SDS上樣緩沖液, 100 ℃加熱煮沸10 min, 讓蛋白充分變性。用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白, 100 V恒壓電泳90 min。隨后用Bio-Rad半干轉膜槽將蛋白樣品轉印到PVDF膜上,條件為25 V恒壓轉膜30 min。轉膜完成后,用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h, 后加入兔抗SIRT1抗體稀釋液(1∶1 000)或兔抗GAPDH抗體稀釋液(1∶3 000) 4 ℃孵育過夜,經TBST緩沖液漂洗3次后,加入HRP山羊抗兔IgG稀釋液(1∶8 000)室溫孵育2 h, 最后用Bio-Rad凝膠成像儀獲取蛋白印跡圖像。

1.2.4 CCK-8實驗檢測細胞活力: 各組細胞培養在96孔細胞培養板中,每組設置3個復孔。每孔加入10 μL CCK-8檢測液,繼續放置在37 ℃培養箱中孵育2 h, 后取出96孔細胞培養板,用酶標儀讀取450 nm處吸光值。

1.2.5 JC-1檢測線粒體膜電位: 細胞培養在24孔細胞培養板中,細胞分別加入500 μL JC-1溶液,在37 ℃培養箱中孵育20 min后,棄掉培養基,再用1 mL緩沖液漂洗2次。染色完成后,胰酶消化、離心并重懸細胞,用BD Calibur流式細胞儀檢測FL-1及FL-2通道熒光信號,并計算FL-2/FL-1熒光強度比值。

1.2.6 ELISA實驗檢測TNF-α、IL-1β的表達: 細胞加入無血清IMDM培養基培養24 h, 收集培養基,在4 ℃、1 000 g條件下離心10 min。取上清,與標準品一起分別加入預先包被抗體的ELISA 96孔檢測板中,每孔100 μL, 4 ℃孵育2 h。隨后用漂洗緩沖液洗5次,依次加入檢測抗體、HRP二抗,4 ℃孵育2 h。最后加入顯色底物反應15 min, 再加入終止液。采用酶標儀讀取450 nm處吸光值,并根據標準曲線計算各組細胞培養基中TNF-α、IL-1β濃度。

1.2.7 MDA檢測: 采用RIPA細胞裂解液裂解各組細胞,并配制50.0、25.0、10.0、5.0、2.5、1.0、0.5、0 nmol/mL濃度的MDA標準品,各取100 μL加入到1.5 mL離心管中,隨后每管加入200 μL MDA檢測工作液充分混勻,并用沸水浴加熱10 min。樣品經1 000 g離心10 min后,將100 μL上清轉移到96孔細胞培養板中,采用酶標儀讀取532 nm吸光值,并根據標準品濃度繪制標準曲線,計算各組MDA濃度。

1.2.8 SOD活力檢測: 采用SOD樣品制備液裂解各組細胞,并將制備100.0、50.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.0 U/mL SOD標準品稀釋液。取20 μL細胞裂解液加入96孔細胞培養板,而后分別加入160 μL WST-8酶緩沖液和20 μL反應啟動液, 37 ℃孵育30 min。最后用酶標儀讀取450 nm處吸光度值,并計算各組SOD活力。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 LPS應激對大鼠AEC2細胞SIRT1表達的影響

實時熒光定量PCR實驗結果表明,模型組大鼠AEC2細胞SIRT1mRNA表達水平為(3.67±0.24), 高于對照組的(1.08±0.04), 差異有統計學意義(t=18.44,P<0.001)。Western blot實驗結果也表明,模型組大鼠AEC2細胞SIRT1蛋白表達水平也呈現升高趨勢。通過慢病毒轉染SIRT1 shRNA, 實時熒光定量PCR結果表明,轉染SIRT1 shRNA慢病毒的實驗組SIRT1mRNA表達水平下降[(3.67±0.24)與(2.13±0.29)], 差異有統計學意義(t=7.09,P=0.002)。Western blot實驗也表明,與模型組相比,實驗組SIRT1蛋白表達水平下降。見圖1。

圖1 Western blot檢測SIRT1表達水平

2.2 敲低SIRT1對細胞活性的影響

CCK-8實驗結果表明,模型組大鼠AEC2細胞在體外培養24 h后的細胞活性為(0.44±0.03), 低于對照組的(0.98±0.06), 差異有統計學意義(t=13.94,P<0.001); 實驗組大鼠AEC2細胞在體外培養24 h后的細胞活性為(0.67±0.05), 高于模型組的(0.44±0.03), 差異有統計學意義(t=6.83,P=0.002)。

2.3 敲低SIRT1對TNF-α和IL-1β表達的影響

實時熒光定量PCR結果表明,與對照組相比,模型組大鼠AEC2細胞TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表達水平均升高,差異有統計學意義(t=8.68,P=0.001;t=10.33,P<0.001); 與模型組相比,實驗組AEC2細胞TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表達水平下降,差異有統計學意義(t=3.29,P=0.030;t=3.021,P=0.04)。見圖2。ELISA實驗結果表明,與對照組比較,模型組AEC2細胞培養基中TNF-α、IL-1β水平均升高,差異有統計學意義(t=14.16,P<0.001;t=12.28,P<0.001); 與模型組比較,實驗組AEC2細胞培養基中的TNF-α、IL-1β水平下降,差異有統計學意義(t=5.22,P=0.006;t=3.46,P=0.03)。見表1。

表1 3組細胞培養基中TNF-α及IL-1β水平比較 pg/mL

與對照組比較, *P<0.05; 與模型組比較, #P<0.05。圖2 3組TNF-α mRNA、IL-1β mRNA表達水平

2.4 敲低SIRT1對肺泡上皮細胞線粒體膜電勢的影響

流式細胞術實驗結果表明,模型組AEC2細胞JC-1紅色熒光與綠色熒光信號比值(JC-1 FL2/JC-1 FL2)為(1.18±0.13), 低于對照組的(3.76±0.25),差異有統計學意義(t=15.86,P<0.001), 表明線粒體膜電位下降; 實驗組AEC2細胞JC-1 FL2/JC-1 FL2為(1.96±0.17), 高于模型組的(1.18±0.13), 差異有統計學意義(t=6.31,P=0.003), 表明線粒體膜電位升高。見圖3。

圖3 流式細胞術檢測各組細胞線粒體膜電位

2.5 敲低SIRT1對細胞氧化應激的影響

與對照組相比,模型組大鼠AEC2細胞MDA水平升高(t=5.04,P=0.007), SOD活性下降(t=4.44,P=0.012), 差異有統計學意義; 與模型組相比,實驗組大鼠AEC2細胞MDA水平下降(t=2.84,P=0.047), SOD活性升高(t=3.38,P=0.028), 差異有統計學意義。見表3。

表3 3組細胞MDA、SOD水平比較

3 討 論

炎癥誘導的AEC2細胞損傷是COPD疾病進展和急性加重的重要過程[10], 揭示AEC2細胞損傷的調控機制,可以為緩解相關疾病的進展及治療提供新的干預手段。本研究發現,在LPS誘導的大鼠AEC2炎性損傷過程中,SIRT1mRNA和蛋白表達水平均顯著升高,這提示SIRT1可能參與了AEC2細胞的炎性損傷,該結論進一步通過對體外培養的AEC2細胞活性檢測實驗證實,即LPS模型大鼠AEC2細胞活性顯著低于對照組,通過轉染SIRT1 shRNA慢病毒可顯著下調AEC2細胞SIRT1的表達,且在敲低SIRT1的AEC2細胞中,細胞活力得到恢復。該結果表明SIRT1是AEC2細胞炎性損傷的重要調節因子。

LPS主要由細胞的Toll樣受體4(TLR4)識別,并通過NF-κB和JNK/SAPK信號通路調控一系列細胞生理活動,如細胞因子分泌[11]、細胞凋亡[12]等,以響應感染應激。本研究發現模型組AEC2分泌的促炎因子TNF-α和IL-1β均升高,而敲低SIRT1則抑制了促炎因子的表達和分泌。線粒體是細胞內能量代謝中樞和細胞凋亡的調控中樞,正常情況下,線粒體內膜兩側由不對稱分布的離子形成膜電位,以維持電子傳遞及氧化磷酸化[13]。本研究發現, LPS誘導的AEC2炎癥損傷中,線粒體膜電位下降,且敲低SIRT1可以在一定程度上恢復線粒體膜電位。線粒體膜電位的下降導致氧化磷酸化解偶聯,影響細胞能量代謝,進而導致細胞凋亡[14]。該結果提示SIRT1可能調控了AEC2細胞線粒體起始的細胞凋亡。線粒體氧化磷酸化功能的異常可能會導致細胞活性氧(ROS)積累,進而引起細胞內的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化,產生MDA[15]。本研究發現,在LPS誘導的AEC2細胞損傷中, MDA水平顯著升高,而且負責清除ROS的SOD活性則呈現下降趨勢。敲低SIRT1的表達顯著抑制了MDA的升高,且部分恢復了SOD的活性,這表明SIRT1也參與了細胞氧化應激的調控。研究[16]發現SIRT1可以通過對NF-κB p65亞基第310位賴氨酸殘基的去乙酰化,抑制NF-κB信號通路,發揮抗炎的作用。本研究卻發現SIRT1在炎性誘導的AEC2細胞損傷中表達水平呈現上調趨勢,這提示SIRT1很可能參與了多種不同信號通路的調控。

綜上所述,本研究僅在細胞層面探討了SIRT1在LPS誘導AEC2細胞損傷的功能,發現了SIRT1對促炎因子分泌、線粒體膜電位和細胞氧化還原穩態的調控作用,表明SIRT1促進了LPS誘導的AEC2細胞損傷,為細菌感染導致的COPD急性加重的治療提供了新的基礎。