艾納香中艾納香素的提取工藝優(yōu)化及抗菌消炎活性評(píng)價(jià)Δ

齊維金，劉瑞秀，潘淑娟，何賢芳，王鴻穎，王 魯（1.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州大學(xué)西南特色藥用生物資源開發(fā)利用教育部工程研究中心，貴陽 550025）

艾納香Blumea balsamifera（L.）DC.為菊科艾納香屬植物，具有抗腫瘤、抗氧化、消炎、抗菌、鎮(zhèn)痛等多種藥理活性[1]，在苗族、黎族、壯族等少數(shù)民族地區(qū)有著悠久的用藥歷史，是一種重要的民族藥。種植戶常用水蒸氣蒸餾法提取艾納香中的“艾片”和“艾油”，剩下的水溶性物質(zhì)及藥渣常被作為廢棄物丟棄，但其廢棄物中包含具有抗腫瘤、抗血栓等藥理活性的黃酮類成分[2—3]。艾納香素是艾納香中一種重要的黃酮類化合物，能夠?qū)?shí)驗(yàn)性肝損傷起保護(hù)作用，對(duì)口腔癌細(xì)胞及肥大細(xì)胞活化脫顆粒反應(yīng)均存在有效的抑制作用[4—5]。但艾納香素作為艾納香的主要活性成分之一，是否具有艾納香那樣良好的抗菌消炎活性目前尚不得知。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，艾納香中艾納香素的含量最高可達(dá)2.60 mg/g[6]，但艾納香素的提取工藝研究較少，導(dǎo)致其價(jià)格昂貴，從而阻礙了艾納香素的開發(fā)。因此，本研究采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化從艾納香中提取艾納香素的工藝，并通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)艾納香素的抗菌消炎活性，以期為艾納香的合理利用（包括其提取廢棄物的回收利用）、新型抗菌消炎藥物的研發(fā)，以及進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)艾納香素的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Agilent 1260型高效液相色譜（HPLC）儀（美國Agilent公司）、SW-CJ-ID型單人凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、ZQLY-180N型振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）、AR1530/C 型電子分析天平（美國Ohaus公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

艾納香莖葉購自貴州羅甸縣種植戶，經(jīng)貴州大學(xué)植物物種鑒定中心王華磊教授鑒定為艾納香B. balsamifera（L.） DC.原植物[鑒定號(hào)2018（033）]；艾納香素標(biāo)準(zhǔn)品（用于HPLC 和核磁共振-質(zhì)譜鑒定，批號(hào)20052223，純度＞98%）購自上海同田生物技術(shù)有限公司；艾納香素（用于抗菌消炎活性檢測，純度＞98%）由貴州省生化工程中心自提；地塞米松（批號(hào)201112，純度99.3%）購自浙江仙琚制藥有限公司；頭孢呋辛鈉（批號(hào)20220804，純度99.25%）購自北京索萊寶科技有限公司；化膿鏈球菌（ATCC 19615）、金黃色葡萄球菌（ATCC 13565）、無乳鏈球菌（ATCC 13813）、變異鏈球菌（ATCC 25175）、枯草芽孢桿菌（ATCC 6633）、藤黃微球菌（ATCC 7468）均購自中國食品藥品檢定研究院；10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯（批號(hào)200226）購自上海博微生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)昆明小鼠200 只，雌雄各半，體重（20±2） g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2019-0010。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理分委員會(huì)審核批準(zhǔn)（倫理批件號(hào)為EAE-GZU-2021-T018）。

2 方法與結(jié)果

2.1 艾納香素的含量測定

2.1.1 溶液的制備

精密稱取艾納香素標(biāo)準(zhǔn)品適量，以甲醇配制成質(zhì)量濃度為78 μg/mL 的艾納香素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密稱取艾納香干燥莖葉粉末，經(jīng)超聲提取2 h（提取溫度40 ℃、功率180 W、頻率40 kHz）后過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.2 色譜條件

色譜柱為Agilent-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液（60∶40，V/V）；柱溫為30 ℃；流速為0.8 mL/min；檢測波長為290 nm；進(jìn)樣量為10 μL。在該色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液中艾納香素的保留時(shí)間約為11.30 min，其HPLC圖見圖1（空白對(duì)照的圖譜略）。

圖1 艾納香素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液的HPLC圖

2.1.3 線性關(guān)系考察

精密吸取艾納香素標(biāo)準(zhǔn)品溶液4、8、12、16、20 μL，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝449.89X—138.96（R2＝0.998 0）。結(jié)果表明，艾納香素的進(jìn)樣量在0.31～1.56 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一批供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，峰面積的RSD為0.75%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取艾納香干燥莖葉粉末，按“2.1.1”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示，樣品平均含量的RSD為1.66%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批供試品溶液，分別于室溫（25 ℃）放置0、4、8、12、24、48 h 后，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄峰面積。結(jié)果顯示，峰面積的RSD 為0.94%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知樣品含量的同一批供試品溶液9 份，分為3 組，分別加入0.1、0.2、0.4 mL 艾納香素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算樣品含量，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，艾納香素的平均加樣回收率分別為99.52%、101.02%、101.21%，RSD 分別為0.83%、1.22%、1.15%（n＝3），表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.2 提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 提取溶劑的篩選

精密稱取艾納香干燥莖葉粉末20 g，按液料比10∶1（mL/g）分別加入甲醇、95%乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯，選擇提取溫度為提取溶劑沸點(diǎn)值，回流提取2 h，考察不同提取溶劑對(duì)艾納香素得率的影響。結(jié)果顯示，艾納香素的得率分別為1.70、1.68、0.51、0.49 mg/g。綜合考慮艾納香素得率和環(huán)保因素，最終選擇95%乙醇作為提取溶劑。

2.2.2 提取時(shí)間的篩選

精密稱取艾納香干燥莖葉粉末20 g，按液料比10∶1（mL/g）加入95%乙醇，于80 ℃分別回流提取1、2、3、4、5、6 h，考察不同提取時(shí)間對(duì)艾納香素得率的影響。結(jié)果顯示，艾納香素的得率分別為1.36、1.55、1.50、1.47、1.42、1.37 mg/g，以提取2 h的得率最高，故選擇提取時(shí)間為2 h。結(jié)果見圖2A。

圖2 提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比對(duì)艾納香素得率的影響

2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)的篩選

精密稱取艾納香干燥莖葉粉末20 g，按液料比10∶1（mL/g）分別加入體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、90%、95%的乙醇，于80 ℃回流提取2 h，考察不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)艾納香素得率的影響。結(jié)果顯示，艾納香素的得率分別為0.61、1.14、1.25、1.69、1.51 mg/g，以90%乙醇提取的得率最高，故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%。結(jié)果見圖2B。

2.2.4 液料比的篩選

精密稱取艾納香干燥莖葉粉末20 g，分別按液料比10∶1、12∶1、14∶1、16∶1、18∶1、20∶1（mL/g）加入95%乙醇，于80 ℃回流提取2 h，考察不同液料比對(duì)艾納香素得率的影響。結(jié)果顯示，艾納香素的得率分別為1.51、1.68、1.72、1.90、1.73、1.42 mg/g，以液料比16∶1（mL/g）的得率最高，故選取液料比為16∶1（mL/g）。結(jié)果見圖2C。

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化艾納香素提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果

通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時(shí)間（B）和液料比（C）作為艾納香素提取工藝優(yōu)化的因素，設(shè)計(jì)合適的因素與水平（表1），并以艾納香素的得率為響應(yīng)值（R），利用Box-Behnken Design原理通過Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，共進(jìn)行了17 組實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。用二階多項(xiàng)式回歸模型預(yù)測響應(yīng)值，得到二次多項(xiàng)表達(dá)式R＝1.94+0.145A+0.002 5B—0.002 5C+0.02AB—0.01BC—0.152A2—0.052B2—0.102C2。對(duì) 回歸方程進(jìn)行方差分析，得回歸模型的F值為39.615 0，差異顯著（P＜0.01）；失擬項(xiàng)（P＞0.05）不顯著；模型的相關(guān)系數(shù)R2＝0.98，大于0.9，說明該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c實(shí)際實(shí)驗(yàn)的相關(guān)性較好，可真實(shí)反映所考察因素對(duì)響應(yīng)值的影響。結(jié)果見表3。

表1 艾納香素提取工藝響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平

表2 艾納香素提取工藝響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 艾納香素提取工藝響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的方差分析結(jié)果

通過Design-Expert 8.0.6 軟件繪制各因素的響應(yīng)面圖及等高線圖（圖3），并結(jié)合方差分析結(jié)果進(jìn)行分析，可得各因素對(duì)艾納香素得率影響的強(qiáng)弱順序?yàn)椋篈＞C＞B，即乙醇體積分?jǐn)?shù)＞液料比＞提取時(shí)間；同時(shí)預(yù)測艾納香素的最優(yōu)提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)89.80%，液料比15.17∶1，以80 ℃回流提取2.02 h。為了便于實(shí)際操作，本研究對(duì)預(yù)測的最優(yōu)提取工藝進(jìn)行了微調(diào)，即得乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，液料比15∶1，以80 ℃回流提取2 h；在此條件下，預(yù)測艾納香素的得率為1.98 mg/g。

圖3 各因素交互作用對(duì)艾納香素得率影響的等高線及響應(yīng)面圖

2.3.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取艾納香干燥莖葉粉末40 g，按上述最優(yōu)提取工藝平行操作3次進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得艾納香素的得率分別為1.95、1.96、2.00 mg/g，平均得率為1.97 mg/g（RSD＝1.34%），與預(yù)測值基本相符，說明提取工藝穩(wěn)定可靠。

2.4 艾納香素的體外抗菌活性考察

采用微量稀釋法進(jìn)行抗菌活性考察[7]。取艾納香素（自提）與頭孢呋辛鈉（陽性對(duì)照）以10%二甲基亞砜溶解配制為適宜濃度梯度的溶液，分別取稀釋好的化膿鏈球菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、變異鏈球菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌的菌液180 μL與藥液20 μL加入96 孔板中，菌液終濃度為105CFU/mL，藥物終濃度為1.56～1 600 μg/mL；于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，裸眼觀察，以孔內(nèi)液體澄清無沉淀的最小質(zhì)量濃度為最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。選擇艾納香素MIC 值較小的化膿鏈球菌與金黃色葡萄球菌測定最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC），即取上述兩種菌2MIC、4MIC、8MIC質(zhì)量濃度的孔內(nèi)液體接種于瓊脂平板，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以平板內(nèi)菌落個(gè)數(shù)小于4 的最小質(zhì)量濃度為MBC。結(jié)果見表4。

表4 艾納香素體外抗菌活性考察結(jié)果（μg/mL）

由表4可知，上述幾種菌株對(duì)艾納香素的敏感度為：化膿鏈球菌＞金黃色葡萄球菌＞無乳鏈球菌＝變異鏈球菌＞枯草芽孢桿菌＞藤黃微球菌；其中，艾納香素對(duì)化膿鏈球菌的MIC值達(dá)50 μg/mL，僅比頭孢呋辛鈉對(duì)化膿鏈球菌的MIC值高37.50 μg/mL。

2.5 艾納香素的消炎活性評(píng)價(jià)

2.5.1 對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響

將50 只昆明小鼠隨機(jī)分為5 組，即陽性對(duì)照組（地塞米松，10 mg/kg），空白對(duì)照組，艾納香素（自提）低、中、高劑量組（7.5、15、30 mg/kg），每組10只。各給藥組按上述劑量腹腔注射給藥，空白對(duì)照組給予等量生理鹽水。在給藥5 h 后，每只小鼠右耳涂抹30 μL 二甲苯致炎，左耳不涂任何藥物。30 min 后處死小鼠，以6 mm 打孔器打下耳片并稱重，以左右耳片的差值為耳廓腫脹度[8]，并計(jì)算腫脹抑制率：腫脹抑制率（%）＝（空白對(duì)照組平均耳廓腫脹度—藥物組平均耳廓腫脹度）/空白對(duì)照組平均耳廓腫脹度×100%。平行2次實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組和艾納香素各劑量組小鼠的耳廓腫脹度均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），但隨著艾納香素劑量的升高，其腫脹抑制率反而下降。與陽性對(duì)照組比較，艾納香素中、高劑量組小鼠的耳廓腫脹度均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表5。

表5 艾納香素對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹影響的結(jié)果（±s，n＝10）

表5 艾納香素對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹影響的結(jié)果（±s，n＝10）

—：無相應(yīng)數(shù)據(jù)；a：與空白對(duì)照組比較，P＜0.01；b：與陽性對(duì)照組比較，P＜0.05；c：與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；d：與陽性對(duì)照組比較，P＜0.01。

組別空白對(duì)照組陽性對(duì)照組艾納香素低劑量組艾納香素中劑量組艾納香素高劑量組腫脹度/mg 7.28±2.99 1.27±0.89a 1.82±0.61a 3.44±1.25ab 5.10±1.38cd腫脹抑制率/%—82.92 75.03 52.69 29.94

2.5.2 對(duì)醋酸所致小鼠毛細(xì)血管通透性的影響

取50只昆明小鼠，分組及給藥同“2.5.1”項(xiàng)下。在給藥5 h后，于小鼠尾靜脈注入0.5%伊文思藍(lán)生理鹽水溶液10 mL/kg，腹腔注射0.6%醋酸生理鹽水溶液0.20 mL，20 min 后處死小鼠，開腹用生理鹽水洗滌腹腔，收集洗滌液后加入生理鹽水至10 mL，以2 000 r/min 離心15 min，取上清液用酶標(biāo)儀在590 nm波長處檢測吸光度（A）值[8]，并計(jì)算各組小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的抑制率：抑制率（%）＝（空白對(duì)照組的平均A值—藥物組的平均A值）/空白對(duì)照組的平均A值×100%。平行2 次實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組和艾納香素各劑量組小鼠的A值均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），但隨著艾納香素劑量的升高，其抑制率反而下降。與陽性對(duì)照組比較，艾納香素高劑量組小鼠的A值顯著升高（P＜0.01），其抑制率降低。結(jié)果見表6。

表6 艾納香素對(duì)醋酸所致小鼠毛細(xì)血管通透性影響的結(jié)果（±s，n＝10）

表6 艾納香素對(duì)醋酸所致小鼠毛細(xì)血管通透性影響的結(jié)果（±s，n＝10）

—：無相應(yīng)數(shù)據(jù)；a：與空白對(duì)照組比較，P＜0.01；b：與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；c：與陽性對(duì)照組比較，P＜0.01。

組別空白對(duì)照組陽性對(duì)照組艾納香素低劑量組艾納香素中劑量組艾納香素高劑量組A值（×10）3.44±1.16 1.07±0.68a 1.32±0.84a 1.75±0.64a 2.47±0.99bc抑制率/%—68.94 61.64 49.09 28.32

3 討論

目前艾納香中已發(fā)現(xiàn)的活性成分超過140 種[9]，除揮發(fā)性成分外，黃酮類化合物艾納香素也有很好的生物活性，具有一定的開發(fā)潛力。對(duì)艾納香素的提取與純化，目前報(bào)道的研究主要圍繞純化方式，而少見提取工藝研究。由于天然產(chǎn)物都是先提取再純化，因此艾納香素提取工藝的優(yōu)化研究對(duì)其工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。基于此，本研究以艾納香素得率為考察指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用Box-Behnken 響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，得到提取艾納香素的最優(yōu)工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，液料比15∶1，以80 ℃回流提取2 h。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明優(yōu)化后的提取工藝穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好。本研究受限于植物儲(chǔ)存量，并未進(jìn)行更大規(guī)模的研究，這也是本研究的不足之處；若該工藝進(jìn)行中試實(shí)驗(yàn)，可能需要進(jìn)一步調(diào)試參數(shù)。但該工藝將為艾納香素的進(jìn)一步分離純化提供良好的物質(zhì)基礎(chǔ)，也可為其工業(yè)化生產(chǎn)提供參考數(shù)據(jù)。

本研究為探討艾納香素是否存在抗菌消炎活性，采用體外抗菌實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物炎癥模型進(jìn)行了評(píng)價(jià)。大多數(shù)天然產(chǎn)物對(duì)細(xì)菌的MIC值都很大，有的甚至達(dá)到了mg/mL級(jí)別[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，艾納香素對(duì)化膿鏈球菌具有一定的抗菌活性，其MIC為50.00 μg/mL，僅比陽性對(duì)照頭孢呋辛鈉的MIC值高37.5 μg/mL，因此值得被進(jìn)一步開發(fā)成抗菌藥物。另外，在艾納香素消炎活性的考察中，艾納香素只進(jìn)行了1次腹腔注射給藥，結(jié)果就具有良好的消炎活性；但值得注意的是，艾納香素存在消炎活性與劑量呈負(fù)相關(guān)的現(xiàn)象。對(duì)此，本研究對(duì)更低劑量的艾納香素（3.75 mg/kg）進(jìn)行了小試，發(fā)現(xiàn)該劑量的艾納香素不具有消炎活性，故推測可能存在高劑量艾納香素影響體內(nèi)吸收的情況，這也是未來進(jìn)一步研究的方向。一定量的艾納香素與陽性對(duì)照地塞米松的作用并無顯著差異，這將為艾納香素的藥理學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，也說明艾納香素在臨床上替代激素類消炎藥存在可能性。

綜上所述，本研究優(yōu)化所得的艾納香素提取工藝穩(wěn)定可行；所提取的艾納香素對(duì)化膿鏈球菌具有一定的抗菌活性，且具有良好的消炎活性。