香青蘭有效部位的成分鑒定、指紋圖譜建立及含量測定Δ

何承輝，李紅紅，呂佳敏，鄒國安，阿吉艾克拜爾·艾薩#（.中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所新疆特有藥用資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 8300；.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，烏魯木齊 830004；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 00049）

香青蘭Dracocephalum moldavicaL.為唇形科一年生草本植物，是新疆道地藥材，資源豐富；藥用部位為地上部分，用于治療動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、心絞痛、高血壓、心肌缺血等心血管疾病[1]。目前臨床上使用香青蘭藥材的制劑有9個(gè)，收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（維吾爾藥分冊）》。其中益心巴迪然吉布亞顆粒為香青蘭單味藥組成的制劑[2—3]，國內(nèi)有5個(gè)廠家生產(chǎn)該制劑。益心巴迪然吉布亞顆粒具有補(bǔ)益心腦、利尿、止喘的功效，但該制劑工藝簡單，采用水煎煮后制備成顆粒劑，藥材中部分脂溶性成分未被充分提取。為保證其療效，本課題組采用醇提取和大孔樹脂純化的方法制備了香青蘭有效部位（effect parts ofD.moldavica，EPDM）[4]，主要活性成分有黃酮類化合物[5—6]，如田薊苷（tilianin，TL）、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（luteolin-7-Oβ-D-glucuronide，LG）、香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（diosmetin-7-O-β-D-glucuronide，DG）和芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷（apigenin-7-O-glucuronide，APG）等，具有擴(kuò)張冠脈、降低冠狀動(dòng)脈血管阻力的功能[7]；還有苯丙素類化合物，如迷迭香酸（rosmarinic acid，RA）等，具有抗血栓、抗血小板聚集、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等功能[8—9]。這些EPDM 中的成分都有一定心血管藥理作用，具有很好的研究價(jià)值，但其中仍有未知成分有待研究。

目前關(guān)于EPDM的研究大多集中于藥理方面，如香青蘭總黃酮具有抗心肌缺血、抗動(dòng)脈粥樣硬化、防哮喘等多種藥理作用，可參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞內(nèi)外信號通路[10—12]。但目前對其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的相關(guān)研究較少，僅對EPDM的部分成分進(jìn)行了評價(jià)，未見針對EPDM的化學(xué)輪廓定性分析及指紋圖譜的定量研究。鑒于此，本研究采用高效液相色譜串聯(lián)四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（HPLC-Q-Exactive-MS）聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合數(shù)據(jù)庫篩查、文獻(xiàn)檢索、對照品比對等方式，對EPDM進(jìn)行化學(xué)成分的定性表征，同時(shí)建立EPDM 指紋圖譜及HPLC多成分含量測定方法，為EPDM的全面質(zhì)量評價(jià)和控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

Q-Exactive 型高分辨質(zhì)譜儀、Ultimate 3000 型HPLC儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司； 1260型HPLC儀購自美國Agilent公司。

1.2 主要藥品與試劑

10 批EPDM 均由新疆藥物研究所按文獻(xiàn)[4]方法自制，批 號 分 別 為160726、160727、160728、181016、181017、181018、2011015、2011017、220408、220409（分別編號為S1～S10），純度不低于53.06%。LG、RA 對照品（批號分別為111968-201602、111871-202007，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為97.7%、98.1%）購自中國食品藥品檢定研究院；TL、APG對照品（批號分別為E-1170-20102223、E-2352-20121721，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均不低于98.0%）購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；DG對照品（批號90954，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.3%）購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；乙腈為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合對照品溶液①的配制

精密稱取LG、APG、DG、RA 和TL 對照品適量，用70%乙醇制備成質(zhì)量濃度分別為0.592、0.503、0.485、0.595、0.192 mg/mL 的對照品儲(chǔ)備液。精密吸取上述各成分的對照品儲(chǔ)備液（LG 1.0 mL、APG 0.2 mL、RA 2.0 mL、DG 1.0 mL、TL 5.0 mL），置于同一10 mL容量瓶中，以甲醇定容，即得上述成分質(zhì)量濃度分別為59.20、10.06、97.0、59.50、96.0 μg/mL的混合對照品溶液①。

2.1.2 供試品溶液的制備

精密稱取EPDM 約10.0 mg，置于25 mL 容量瓶中，加入25 mL 甲醇，稱定其質(zhì)量；在功率250 W、頻率40 kHz 條件下超聲30 min，待冷卻至室溫，再次稱定其質(zhì)量；損失的質(zhì)量用甲醇補(bǔ)足，搖勻，使用0.45 μm 濾膜過濾，收集續(xù)濾液，即得。

2.2 HPLC-Q-Exactive-MS 聯(lián)用技術(shù)對EPDM 成分進(jìn)行鑒定

2.2.1 色譜條件

采用Shim-pack-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm×5 μm），以乙腈（A）-0.5%甲酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～23 min，10%A；23～59 min，12%A→26%A；59～70 min，28%A；70～110 min，27%A）；檢測波長為330 nm；柱溫為35 ℃；體積流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣體積為50 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件

使用Q-Exactive 型高分辨質(zhì)譜儀，離子源為可加熱電噴霧離子源，在正、負(fù)離子模式下檢測。鞘氣壓力為35 psi，輔助氣壓力為10 arb，噴霧電壓為2.8（—）、3.3（+） kV，離子傳輸管溫度為320 ℃，輔助氣溫度為310 ℃，碰撞能量為20、40、60 eV；檢測方式為Full MS/dd-MS2，分辨率分別為70 000（+）、17 500（—），掃描范圍為質(zhì)荷比（m/z）100→1 500。采用Thermo Xcalibur 軟件采集數(shù)據(jù)。

2.2.3 化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫的建立與數(shù)據(jù)分析

通過關(guān)鍵詞“dracocephalum” “chemical component”在CNKI、ChEMBL 和PubChem 等數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，將香青蘭屬植物中已報(bào)道的化合物收錄于自建的內(nèi)部數(shù)據(jù)庫中。采用HPLC-Q-Exactive-MS 聯(lián)用技術(shù)在正、負(fù)離子模式下對EPDM 進(jìn)行全掃描，收集數(shù)據(jù)。根據(jù)化合物的保留時(shí)間、精確m/z、特征碎片離子、相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道以及建立的香青蘭屬植物內(nèi)部數(shù)據(jù)庫，推測其可能的結(jié)構(gòu)。

2.2.4 化合物鑒定結(jié)果

正、負(fù)離子模式下EPDM 的總離子流圖見圖1。結(jié)果顯示，共鑒定出11個(gè)化合物，其具體信息見表1。

表1 EPDM中化合物鑒定結(jié)果

2.3 EPDM的HPLC指紋圖譜建立

2.3.1 精密度考察

取“2.1.2”項(xiàng)下EPDM供試品溶液（樣品編號S1），按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，以8 號峰為參照峰（該色譜峰分離度較好，且有較大的峰面積），計(jì)算得各共有峰相對保留時(shí)間的RSD均小于0.04%、相對峰面積的RSD均小于0.48%（n＝6），表明該方法精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性考察

按“2.1.2”項(xiàng)下方法配制6 份EPDM 供試品溶液（樣品編號S1），按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以8號峰為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對保留時(shí)間的RSD均小于0.15%、相對峰面積的RSD均小于4.67%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性考察

按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備EPDM供試品溶液（樣品編號S1），于制備后0、2、4、8、12、24 h，分別按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以8號峰為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對保留時(shí)間的RSD均小于0.23%、相對峰面積的RSD均小于3.17%（n＝6），表明供試品溶液在制備后24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 HPLC指紋圖譜的建立

取10批EPDM樣品，分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再分別按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，收集色譜圖。將10批供試品的色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2004A 版）》，以樣品S1 的圖譜為參照圖譜，設(shè)置時(shí)間窗寬度為0.1 min，采用自動(dòng)匹配方法經(jīng)多點(diǎn)校正后生成指紋圖譜，并以中位數(shù)法生成對照圖譜R，詳見圖2。結(jié)果，10 批樣品共標(biāo)定出了10 個(gè)共有峰。

圖2 10批EPDM的HPLC指紋圖譜和對照圖譜R

2.3.5 共有峰的指認(rèn)

將對照圖譜R與混合對照品的圖譜（取“2.1.1”項(xiàng)下混合對照品溶液①按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定后所得）進(jìn)行對比，共指認(rèn)出5 個(gè)共有色譜峰，其中1 號峰為LG、3 號峰為APG、4 號峰為RA、5 號峰為DG、8 號峰為TL。結(jié)果見圖3。

圖3 對照圖譜R和混合對照品溶液①的HPLC圖

2.3.6 相似度評價(jià)

以對照圖譜R 為參照，通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2004A版）》對10批EPDM樣品進(jìn)行相似度評價(jià)。結(jié)果顯示，樣品S1～S10的指紋圖譜與對照圖譜R 的相似度分別為0.996、0.996、0.995、0.962、0.994、0.977、0.963、0.998、0.986、0.985，均大于0.96，表明10 批EPDM樣品之間的差異較小，其質(zhì)量穩(wěn)定性和均一性良好。結(jié)果見表2。

表2 10批EPDM的相似度評價(jià)結(jié)果

2.4 HPLC法測定EPDM中5種指標(biāo)成分的含量

2.4.1 混合對照品溶液②的配制

分別精密稱取LG、APG、DG對照品適量，用75%甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為149.6、233.0、139.2 μg/mL 的對照品儲(chǔ)備液；精密稱取RA對照品適量，用甲醇配制成218.4 μg/mL 的對照品儲(chǔ)備液；精密稱取TL 對照品適量，用70%乙醇配制成197.5 μg/mL 的對照品儲(chǔ)備液。精密吸取不同體積的各對照品儲(chǔ)備溶液（LG 1.0 mL、APG 1.0 mL、RA 1.0 mL、DG 1.0 mL、TL 2.0 mL）置于同一10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得混合對照品溶液②。

2.4.2 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.4.1”項(xiàng)下混合對照品溶液②0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。將各混合對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得到的回歸方程及線性范圍見表3。結(jié)果顯示，在進(jìn)樣質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線均表現(xiàn)出良好的線性（R2≥0.999）。

表3 EPDM中5種指標(biāo)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

2.4.3 精密度考察

取“2.4.1”項(xiàng)下混合對照品溶液②，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，LG、APG、RA、DG、TL 峰面積的RSD 分別為1.20%、3.18%、0.74%、1.14%、1.17%（n＝6），提示儀器精密度較好。

2.4.4 穩(wěn)定性考察

取“2.1.2”項(xiàng)下EPDM供試品溶液（樣品編號S1），分別于制備后0、2、4、8、12、24 h按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，LG、APG、RA、DG、TL含量的RSD 分別為1.06%、2.31%、0.35%、0.97%、1.08%（n＝6），提示供試品溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性考察

按照“2.1.2”項(xiàng)下方法配制6 份EPDM 供試品溶液（樣品編號S1），按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，按照外標(biāo)法計(jì)算樣品中5種成分含量。結(jié)果顯示，LG、APG、RA、DG、TL含量的RSD分別為1.74%、1.92%、0.58%、1.32%、0.95%（n＝6），提示該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率考察

精密稱取已知5種指標(biāo)成分含量（LG 26.585 3 mg/g、APG 7.401 7 mg/g、RA 43.914 6 mg/g、DG 20.938 9 mg/g、TL 83.675 5 mg/g）的EPDM 粉末6 份，置于25 mL 容量瓶中；精密加入近似等含量的5種對照品儲(chǔ)備溶液，制成供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，LG、APG、RA、DG、TL 的平均加樣回收率分別為97.75%、98.37%、95.12%、95.19%、96.59%，RSD 分別 為1.56%、2.93%、2.57%、2.55%、0.86%（n＝6），提示該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.4.7 含量測定

按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備不同批次（S1～S10）EPDM的供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，按照外標(biāo)法計(jì)算5種指標(biāo)成分的含量。各批次樣品重復(fù)進(jìn)樣測定3 次，計(jì)算平均值。結(jié)果顯示，各成分含量分別為21.268 3～29.243 9 mg/g（LG）、6.365 4～7.771 7 mg/g（APG）、37.327 4～45.671 2 mg/g（RA）、17.169 9～21.985 9 mg/g（DG）、66.940 4～91.206 3 mg/g（TL）。結(jié)果見表4。

表4 10批EPDM中5種指標(biāo)成分含量測定結(jié)果（mg/g，n＝3）

3 討論

本研究比較了不同提取溶劑（50%、70%、100%甲醇）、不同超聲提取時(shí)間（30、40、50 min）對EPDM 中成分提取效率的影響。結(jié)果顯示，甲醇提取液總離子流圖的色譜峰較多、基線噪聲較小，另外超聲時(shí)間不同對提取結(jié)果并無明顯影響。因此，本研究使用甲醇為提取溶劑、超聲提取30 min作為最佳的樣品提取方法。

本研究采用HPLC 法測定了EPDM 中LG、APG、RA、DG、TL 的含量，分別考察了乙腈-0.4%磷酸溶液（27∶73，V/V）等度洗脫、乙腈-0.4%磷酸溶液（20∶80，V/V）等度洗脫、乙腈-0.5%甲酸溶液（10∶90→27∶73）梯度洗脫等流動(dòng)相體系。結(jié)果顯示，使用乙腈-0.5%甲酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，梯度洗脫效果最好，出峰情況良好，色譜峰的分離度較高。因此，本研究選擇乙腈-0.5%甲酸溶液作為流動(dòng)相。

本研究采用HPLC 法，建立了EPDM 的HPLC 指紋圖譜，共標(biāo)定10個(gè)共有峰。相似度評價(jià)結(jié)果表明，10批EPDM 供試品的HPLC 指紋圖譜相似度高，均在0.96 以上，表明各樣品的相似情況良好，且各共有峰保留時(shí)間穩(wěn)定，符合中藥指紋圖譜的技術(shù)要求。并且，本研究建立了5 個(gè)指標(biāo)成分的HPLC 定量分析方法，方法學(xué)考察符合相關(guān)要求。這也說明本研究所建立的成分鑒定、指紋圖譜和定量分析方法穩(wěn)定可行、結(jié)果可靠，適用于EPDM的綜合質(zhì)量評價(jià)和控制。