當歸多糖改善先兆流產模型大鼠Th1/Th2失衡及保胎作用Δ

孫 哲，劉 蓮，張泰魏，王 琪，周意園，張昌容，華詔召#（.貴州中醫藥大學第一附屬醫院婦科，貴陽 55000；.貴州醫科大學臨床微生物與免疫學教研室，貴陽 55000；.貴州中醫藥大學第一附屬醫院優生研究中心，貴陽 55000；.貴州中醫藥大學第二附屬醫院產科，貴陽 55000）

先兆流產是女性妊娠早期出現的腰痛、下腹痛或陰道出血等癥狀，若不及時進行干預治療最終會導致流產，甚至給母體生命安全帶來危害，嚴重影響孕婦身心健康及家庭幸福。免疫細胞分化異常及其產生的細胞因子失衡是妊娠失敗及流產的重要原因，糾正Th1/Th2型細胞因子的病理偏移狀態可改善先兆流產患者內分泌水平，并減輕其癥狀[1—2]。此外，磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信號通路與細胞代謝、免疫調節和激素水平調節有關，參與介導了藥對黃芩-白術對先兆流產的治療過程[3]。激活PI3K/AKT信號通路可降低Th1/Th2比值，減輕免疫炎癥，進而促進腎移植存活[4]；還可減輕巨噬細胞M1 極化，進而通過抑制炎癥來改善脂多糖誘導的小鼠流產癥狀[5]。由此可知，通過激活PI3K/AKT信號通路來改善Th1/Th2平衡可能是防治先兆流產的重要手段。

當歸多糖是中藥當歸中的天然多糖類物質，可通過減少促炎因子的表達和釋放，進而抑制妊娠期易栓癥模型大鼠的血栓形成[6]。此外，胡燕等[7]研究表明，當歸多糖可上調PI3K/AKT 信號通路相關蛋白表達，并降低復發性流產模型大鼠的胚胎死亡率。但當歸多糖是否可通過激活PI3K/AKT信號通路來改善先兆流產患者Th1/Th2平衡，并發揮保胎作用目前還不清楚。鑒于此，本研究通過構建先兆流產大鼠模型，探究當歸多糖調節PI3K/AKT 信號通路對其Th1/Th2 平衡及胚胎存活的影響，旨在闡明當歸多糖防治先兆流產的作用機制。

1 材料

1.1 主要儀器

RAYTO RT-2100C 型自動酶標儀購自北京華儀通泰環保科技有限公司；HS-3090 型冰凍切片機購自北京德耳斯儀器有限公司；EVOS M7000 型顯微鏡、AttuneTMNxT 型流式細胞儀均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；DYY-6C型雙穩電泳儀、HE-120型電泳槽、VE-186型轉印電泳槽均購自南京普陽科學儀器研究所。

1.2 主要藥品與試劑

當歸多糖（批號CY110320，純度98%）購自陜西慈緣生物技術有限公司；米非司酮（批號410003-201301，純度99.5%）、米索前列醇（批號410004-201502，純度98.9%）購自南京森貝伽生物科技有限公司；PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002（批號L9908，純度≥98%）購自美國Sigma公司；大鼠雌激素、孕激素、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、白細胞介素4（interleukin-4，IL-4）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號分別為CB10268-Ra、CB11530-Ra、CB10173-Ra、CB10216-Ra、CB11057-Ra）購自上海科艾博生物技術有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、FITC 標記的抗大鼠CD4 抗體、APC 標記的抗大鼠IFN-γ 抗體、PE標記的抗大鼠IL-4 抗體和兔源抗大鼠磷酸化PI3K（p-PI3K）、PI3K、磷酸化AKT（p-AKT）、AKT、GAPDH 一抗以及HRP 標記的山羊抗兔IgG 二抗購自上海優寧維生物科技股份有限公司；外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）分離試劑盒購自北京匯智和源生物技術有限公司。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級SD大鼠（雄性大鼠27只，約7周齡，體重215～245 g；雌性大鼠54只，約8周齡，體重210～240 g），購自陸軍軍醫大學醫學實驗動物中心，生產合格證號為SCXK（渝）2022-0011。所有大鼠均飼養于貴州中醫藥大學第一附屬醫院SPF級動物房內，動物房內環境條件設為溫度22～25 ℃、相對濕度55%～60%、光照/晝夜各12 h循環。本研究通過了貴州中醫藥大學動物倫理委員會批準（批號為20220018）。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

取SD 雌性大鼠，灌胃己烯雌酚（2 mg/kg）1 次使其發情[8]，然后與SD 雄性大鼠以2∶1 的比例合籠過夜，次日清晨檢查選出成功受孕的雌鼠（成功受孕特征為雌鼠陰道中有陰栓），此時記為妊娠第1天。取成功受孕的雌鼠50只，采用隨機數字表法將其分為對照組、模型組、當歸多糖組、LY294002組和當歸多糖+ LY294002組，每組10只。于妊娠第1天開始給藥處理：對照組和模型組大鼠均灌胃10 mL/kg 生理鹽水+腹腔注射10 mL/kg 生理鹽水，當歸多糖組大鼠灌胃200 mg/kg 當歸多糖[7]+腹腔注射10 mL/kg生理鹽水，LY294002組大鼠灌胃10 mL/kg生理鹽水+腹腔注射5 mg/kg LY294002[9]，當歸多糖+LY294002 組大鼠灌胃200 mg/kg 當歸多糖+腹腔注射5 mg/kg LY294002；每天給藥1 次，連續給藥7 d。于妊娠第8天，模型組和各給藥組大鼠參照文獻[8]制備先兆流產大鼠模型，即上午8：00灌胃8.3 mg/kg米非司酮，并于下午6：00灌胃100 μg/kg米索前列醇誘發先兆流產。對照組大鼠以同樣步驟灌胃等量生理鹽水。然后于妊娠第9天，各組大鼠繼續按照上述給藥方法給藥4 d。

2.2 樣本收集及處理

于妊娠第13天，通過吸入乙醚麻醉各組大鼠后自腹主動脈采集血液，離心后分組采集血清保存在—80 ℃冰箱中備用；再次采集適量腹主動脈血，按PBMC 分離試劑盒說明書方法操作分離出其中PBMC，以含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養備用；稱定大鼠體重后斷頭處死，開腹摘取子宮及卵巢備用。

2.3 大鼠血清中激素和Th1、Th2型細胞因子水平測定

取“2.2”項下大鼠血清于冰水浴中解凍后，按照ELISA 試劑盒方法檢測血清中雌激素、孕激素、IFN-γ、TNF-α、IL-4水平。

2.4 大鼠子宮卵巢指數及胚胎死亡率測定

取“2.2”項下各組大鼠的子宮及卵巢，使用小剪刀剪開子宮后觀察胚胎生長情況并計數，正常發育胚胎呈淡紅色且個體較大，胎鼠輪廓清晰且胎膜完整；死亡胚胎個體小并呈“竹節狀”，胎膜結構不完整或不存在，胚胎呈黑褐色并有消失跡象或已經消失。按下述公式計算各組孕鼠胚胎死亡率：胚胎死亡率＝死亡胚胎數/（正常胚胎數+死亡胚胎數）×100%。取出胚胎后，剝離宮腔及卵巢的脂肪組織，稱定子宮和卵巢質量，按下述公式計算各組孕鼠子宮卵巢指數：子宮卵巢指數（mg/g）＝[子宮質量+卵巢質量（mg）]/體重（g）。

2.5 大鼠子宮組織形態觀察

剪下“2.2”項下各組大鼠的一部分子宮組織，包埋后于液氮內速凍，修剪為小方塊后置于冰凍切片機內進行連續切片，得到厚約5 μm的切片進行復溫；以預冷丙酮固定10 min，再進行HE染色，經洗滌、封片后，采用光學顯微鏡觀察并任選6個視野采集圖像。

2.6 大鼠外周血中Th1、Th2細胞比例及兩者比值測定

取“2.2”項下各組大鼠的PBMC 并計數，每組取約2×106個PBMC，以FITC 標記的抗大鼠CD4 抗體孵育，洗滌后以固定/透化稀釋液和透化緩沖液孵育；依次孵育APC 標記的抗大鼠IFN-γ 抗體和PE 標記的抗大鼠IL-4抗體，再次洗滌后用流式細胞儀檢測其中Th1、Th2細胞的比例并計算Th1/Th2比值。

2.7 大鼠子宮組織中PI3K/AKT 信號通路相關蛋白表達測定

取“2.2”項下各組大鼠的子宮組織，提取其總蛋白并于沸水浴中加熱變性，對總蛋白進行定量分析。取20μg 總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（在120 V 恒壓下電泳80 min），然后在40 mA 穩定電流下濕轉90 min至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，以3%牛血清白蛋白封閉2 h；依次加入兔源抗大鼠p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、GAPDH 一抗（稀釋比例均為1∶2 000），4 ℃孵育過夜；洗膜后，加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例為1∶1 000），室溫孵育2 h。化學發光法顯色后采集各組蛋白條帶圖像，運用Image-pro 6.0圖像分析軟件分析條帶灰度值。以目的蛋白和內參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平，PI3K、AKT的磷酸化水平分別以p-PI3K與PI3K相對表達水平的比值和p-AKT與AKT相對表達水平的比值表示。

2.8 統計學分析

采用SPSS 26.0軟件進行統計分析。計量資料采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 大鼠血清中雌激素與孕激素水平測定結果

與對照組比較，模型組大鼠血清中雌激素、孕激素水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，當歸多糖組大鼠血清中雌激素、孕激素水平均顯著升高（P＜0.05），而LY294002組大鼠血清中雌激素、孕激素水平均顯著降低（P＜0.05）。與當歸多糖組比較，當歸多糖+LY294002 組大鼠血清中雌激素、孕激素水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見表1。

表1 各組大鼠血清中激素和Th1、Th2 型細胞因子水平測定結果（±s，n＝10，pg/mL）

表1 各組大鼠血清中激素和Th1、Th2 型細胞因子水平測定結果（±s，n＝10，pg/mL）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與當歸多糖組比較，P＜0.05。

IL-4 19.84±3.59 6.23±1.02a 17.52±3.14b 2.20±0.43b 7.49±1.15c組別對照組模型組當歸多糖組LY294002組當歸多糖+LY294002組雌激素1.28±0.14 0.59±0.07a 1.23±0.16b 0.29±0.05b 0.63±0.08c孕激素154.81±32.40 83.25±11.73a 146.34±30.12b 27.96±5.50b 91.12±12.06c IFN-γ 2.64±0.35 5.87±0.63a 2.95±0.40b 7.74±0.75b 5.53±0.58c TNF-α 23.79±4.10 64.82±8.25a 29.35±4.33b 86.43±9.41b 56.10±7.94c

3.2 大鼠血清中Th1、Th2型細胞因子水平測定結果

與對照組比較，模型組大鼠血清中IFN-γ、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.05），IL-4水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，當歸多糖組大鼠血清中IFN-γ、TNF-α水平均顯著降低（P＜0.05），IL-4水平顯著升高（P＜0.05）；而LY294002組大鼠血清中IFN-γ、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.05），IL-4 水平顯著降低（P＜0.05）。與當歸多糖組比較，當歸多糖+LY294002 組大鼠血清中IFN-γ、TNF-α 水平均顯著升高（P＜0.05），IL-4 水平顯著降低（P＜0.05）。結果見表1。

3.3 大鼠子宮卵巢指數及胚胎死亡率測定結果

與對照組比較，模型組大鼠子宮卵巢指數顯著降低（P＜0.05），胚胎死亡率顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，當歸多糖組大鼠子宮卵巢指數顯著升高（P＜0.05），胚胎死亡率顯著降低（P＜0.05）；而LY294002 組大鼠子宮卵巢指數顯著降低（P＜0.05），胚胎死亡率顯著升高（P＜0.05）。與當歸多糖組比較，當歸多糖+LY294002 組大鼠子宮卵巢指數顯著降低（P＜0.05），胚胎死亡率顯著升高（P＜0.05）。結果見表2。

表2 各組大鼠子宮卵巢指數及胚胎死亡率測定結果（±s，n＝10）

表2 各組大鼠子宮卵巢指數及胚胎死亡率測定結果（±s，n＝10）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與當歸多糖組比較，P＜0.05。

胚胎死亡率/%3.35±0.82 71.54±9.36a 9.42±1.75b 94.62±12.31b 68.95±10.11c組別對照組模型組當歸多糖組LY294002組當歸多糖+LY294002組子宮卵巢指數/（mg/g）11.42±2.46 2.28±0.43a 10.03±2.21b 1.37±0.10b 2.65±0.39c

3.4 大鼠子宮組織形態觀察結果

對照組大鼠子宮內膜形態正常，細胞結構規則且排列緊密；模型組大鼠子宮內膜變薄且結構不完整，細胞排列疏松，間質內有炎癥細胞浸潤，產生病理損傷；當歸多糖組大鼠子宮組織病理損傷相比模型組減輕，LY294002 組大鼠子宮組織病理損傷相比模型組加重；當歸多糖+LY294002 組大鼠子宮組織病理損傷相比當歸多糖組加重。結果見圖1。

圖1 各組大鼠子宮組織形態觀察顯微圖（HE染色）

3.5 大鼠外周血中Th1、Th2細胞比例及兩者比值測定結果

與對照組比較，模型組大鼠外周血中Th2細胞比例顯著降低（P＜0.05），Th1細胞比例、Th1/Th2比值均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，當歸多糖組大鼠外周血中Th2 細胞比例顯著升高（P＜0.05），Th1 細胞比例、Th1/Th2 比值均顯著降低（P＜0.05）；而LY294002 組大鼠外周血中Th2細胞比例顯著降低（P＜0.05），Th1細胞比例、Th1/Th2比值均顯著升高（P＜0.05）。與當歸多糖組比較，當歸多糖+LY294002 組大鼠外周血中Th2 細胞比例顯著降低（P＜0.05），Th1細胞比例、Th1/Th2比值均顯著升高（P＜0.05）。結果見圖2、表3。

圖2 各組大鼠外周血中Th1、Th2 細胞比例檢測的流式細胞圖

表3 各組大鼠外周血中Th1、Th2 細胞比例及兩者比值測定結果（±s，n＝10）

表3 各組大鼠外周血中Th1、Th2 細胞比例及兩者比值測定結果（±s，n＝10）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與當歸多糖組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組當歸多糖組LY294002組當歸多糖+LY294002組Th1細胞比例/%1.87±0.40 6.23±0.85a 2.04±0.51b 10.12±0.96b 5.86±0.72c Th2細胞比例/%5.42±0.76 1.14±0.23a 5.03±0.83b 0.60±0.08b 1.37±0.22c Th1/Th2比值0.35±0.05 5.46±0.94a 0.41±0.08b 16.87±1.85b 4.28±0.72c

3.6 大鼠子宮組織中PI3K、AKT磷酸化水平測定結果

與對照組比較，模型組大鼠子宮組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 比值均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，當歸多糖組大鼠子宮組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 比值均顯著升高（P＜0.05），而LY294002 組大鼠子宮組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 比值均顯著降低（P＜0.05）。與當歸多糖組比較，當歸多糖+LY294002組大鼠子宮組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 比值均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖3、表4。

圖3 各組大鼠子宮組織中PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達電泳圖

表4 各組大鼠子宮組織中PI3K、AKT 磷酸化水平測定結果（±s，n＝10）

表4 各組大鼠子宮組織中PI3K、AKT 磷酸化水平測定結果（±s，n＝10）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與當歸多糖組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組當歸多糖組LY294002組當歸多糖+LY294002組p-PI3K/PI3K 0.78±0.13 0.41±0.04a 0.75±0.10b 0.12±0.03b 0.44±0.07c p-AKT/AKT 0.84±0.12 0.43±0.06a 0.79±0.13b 0.15±0.03b 0.47±0.08c

4 討論

目前，臨床對先兆流產的治療以服用孕激素、注射黃體酮等方法為主，但長期采用上述方法治療存在局限性并有一定副作用，因此尋找更安全有效的防治流產的方法具有重要臨床意義[1—2]。Th1/Th2 的動態平衡在妊娠過程中起到重要作用。Th1/Th2型細胞應答出現生理性失衡，會導致Th1細胞分泌的促炎因子IFN-γ、TNF-α等增加及Th2 細胞分泌的抑炎因子IL-4、IL-10 等減少，進而引發免疫炎癥，這是造成先兆流產的主要病理基礎。相關研究發現，通過增強妊娠期婦女Th1/Th2 的動態平衡向Th2偏移可促使胚胎正常發育生長，降低流產的發生概率[10—11]。本研究通過灌胃米非司酮和米索前列醇建立先兆流產大鼠模型，結果顯示，造模大鼠雌激素與孕激素分泌異常降低，Th1/Th2 免疫失衡且偏向Th1，促使Th1 型細胞因子表達并減輕Th2 型細胞因子表達，誘發免疫炎癥，造成子宮及卵巢形態受損，引發胚胎死亡，最終導致先兆流產，這提示模型構建成功。

先兆流產在中醫中屬于“胎動不安”“胎漏”“滑胎”，治療以扶脾固腎、養血益氣為主[8]。當歸作為常用中藥材具有補腎益精、補血益氣的功效，可調節子宮局部免疫細胞分化及其分泌的與妊娠相關的細胞因子表達，進而降低誘導性流產模型小鼠胚胎死亡率[12]。當歸多糖作為當歸的主要活性成分之一，可通過促進微血管形成而增加子癇前期模型大鼠胎盤血流灌注，促使其胎鼠存活，最終改善其不良妊娠結局[13]。本研究以當歸多糖干預先兆流產模型大鼠后，可減輕其子宮組織病理損傷，促使其雌激素、孕激素分泌，升高其血清中IL-4水平、子宮卵巢指數、Th2 細胞比例，并降低其胚胎死亡率、Th1細胞比例、Th1/Th2比值和血清中IFN-γ、TNF-α水平，表明當歸多糖可調控Th1/Th2免疫平衡并糾正其偏向Th1的失衡狀態，減輕免疫炎癥及子宮損傷，促使胚胎存活，最終改善大鼠先兆流產癥狀。該結果提示，當歸多糖在先兆流產的臨床治療中具有廣闊應用前景。

PI3K/AKT 信號通路可通過調控免疫、激素分泌及細胞存活等介導妊娠過程，并與先兆流產的發生及治療相關[3]，增強PI3K/AKT信號通路活性可促進血管內皮生長因子表達及子宮變厚，進而改善控制性超促排卵大鼠的子宮內膜容受性并促進胚胎植入[14]。Yang 等[15]研究發現，PI3K/AKT信號通路參與介導了菟絲子-茯苓藥對治療先兆流產的過程；且胡燕等[7]研究表明，當歸多糖可激活PI3K/AKT 信號通路，進而改善復發性流產模型大鼠激素水平和凝血指標并降低其流產率。因而筆者預測，當歸多糖改善先兆流產模型大鼠Th1/Th2 平衡發揮保胎作用的藥理機制可能是激活了PI3K/AKT 信號通路。本研究結果顯示，先兆流產模型大鼠子宮組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 比值相比對照組大鼠降低，即PI3K、AKT 的磷酸化水平降低，以當歸多糖處理后可逆轉其變化趨勢；而以該通路抑制劑LY294002 干預先兆流產模型大鼠，可加重免疫炎癥及子宮損傷，進一步損害胚胎發育并升高其死亡率，使大鼠先兆流產病情加重。這表明PI3K/AKT信號通路參與了先兆流產的發生過程，并介導了當歸多糖對先兆流產模型大鼠的保胎作用及Th1/Th2 平衡的改善過程。本研究以當歸多糖和LY294002 聯合處理先兆流產模型大鼠，可減弱當歸多糖單獨處理對大鼠Th1/Th2免疫平衡偏向Th2的促進作用，消除其對免疫炎癥及子宮損傷的減輕作用，最終逆轉其對大鼠先兆流產癥狀的改善作用。這進一步證實了當歸多糖改善先兆流產模型大鼠Th1/Th2平衡并對其發揮保胎作用是通過激活PI3K/AKT信號通路實現的。

綜上所述，當歸多糖可通過激活PI3K/AKT 信號通路，進而調控Th1/Th2平衡并促使其偏向Th2，抑制免疫炎癥的發生及進展，減輕子宮損傷并促使胚胎存活，從而發揮對先兆流產模型大鼠的保胎作用。