PNU-282987對顳葉癲癇模型大鼠認知功能的影響及機制Δ

李永格，周 舒，劉慶春，未小明，張 冬，馬鳳巧（.南陽醫學高等專科學校基礎醫學部，河南 南陽 473000；2.昆明醫科大學生物醫學工程研究中心，昆明 650000）

癲癇是由腦神經元突發異常放電導致神經系統功能障礙的常見慢性腦部疾病。癲癇患者中有約30%～40%會發展成為藥物難治性癲癇，臨床上以顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy，TLE）最為常見[1]。TLE 易反復發作，可引起海馬神經元大量凋亡壞死，常伴隨認知功能障礙，主要表現為患者學習記憶能力降低，嚴重威脅其身心健康[2]。研究發現，神經炎癥與癲癇的發生、發展以及認知功能障礙密切相關[3]。小膠質細胞作為神經系統內參與調節神經炎癥的關鍵免疫細胞，其過度激活會導致炎癥因子的大量產生，引起中樞神經元損傷，是導致TLE的病理因素之一[4]。因此，抑制小膠質細胞活化，減輕神經炎癥導致的神經元損傷，可能成為TLE的治療新策略。

膽堿能抗炎通路（cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP）可通過刺激迷走神經釋放乙酰膽堿（acetylcholine，ACh），并與巨噬細胞等免疫細胞上的α7 煙堿型乙酰膽堿受體（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR）相結合來減輕機體炎癥反應，是體內重要的神經免疫調節通路；其中，α7nAChR是CAP的核心信號受體，除分布在外周組織器官外，海馬小膠質細胞上也有大量分布[5]，激活α7nAChR 能夠抑制小膠質細胞的活化[6]。核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是細胞內的信號分子，α7nAChR 被激活后，能夠抑制NF-κB 的磷酸化和核遷移，降低促炎因子的表達[7]。由此可知，α7nAChR/NF-κB 信號通路具有調節小膠質細胞激活、抑制中樞炎癥反應的作用。PNU-282987（分子式為C14H17ClN2O）是一種固態的、晶體狀的高選擇性α7nAChR激動劑，可作用于α7nAChR/NF-κB信號通路，減輕阿爾茨海默病[8]、膿毒癥腦病[9]等疾病的中樞炎癥反應，保護神經元[10]，但其能否在TLE 中發揮作用還未見相關報道。基于此，本研究首先建立TLE模型大鼠，考察PNU-282987 對模型大鼠認知功能的影響，并基于α7nAChR/NF-κB信號通路初探其作用機制，以期為TLE的治療提供新思路與新靶點。

1 材料

1.1 實驗動物

本研究所用動物為SPF級SD雄性大鼠，共60只，體重290～310 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物生產許可證號為SCXK（京）2019-0008。所有大鼠均于晝夜節律自然變化、室溫23～25 ℃、相對濕度50%～60%的環境下飼養，自由攝食、飲水。本實驗獲得南陽醫學高等專科學校倫理委員會批準，批準號為南陽醫專動倫[2022]第005號。

1.2 主要藥品與試劑

PNU-282987（批號M06398，純度99.37%）購自北京百奧萊博科技有限公司；甲基牛扁亭（methyllycaconitine，MLA）（α7nAChR 阻斷劑，批號M-168，純度99.03%）購自美國Sigma公司；氯化鋰（批號L511）購自湖北威德利化學試劑有限公司；東莨菪堿（批號H32022184）購自徐州萊恩藥業有限公司；毛果蕓香堿（批號YJ102834）購自上海一基實業有限公司；腫瘤壞死因子ɑ（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和IL-1β 酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號分別為ml102828、ml002859、ml037373）購自上海酶聯生物科技有限公司；RIPA 蛋白裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒、ECL 顯影液（批號分別為89900、NCI3225、32209）購自英濰捷基（上海）貿易有限公司；兔源α7nAChR 多克隆抗體、小鼠源離子鈣接頭蛋白1（ionized calcium-binding adapter molecule-1，IBA-1）單克隆抗體（批號分別為ab10096、ab283319）購自英國Abcam 公司；兔源NF-κB p65 多克隆抗體、兔源磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）多克隆抗體（批號分別為8242、3033）購自美國Cell Signaling 公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 二抗（批號BA1055）購自武漢博士德生物工程有限公司；Alexa Fluor 594標記的羊抗小鼠IgG二抗（批號115-585-146）購自美國Jackson 公司；尼氏染色試劑盒（批號C0117）購自上海碧云天生物技術有限公司等。

1.3 主要儀器

Morris 水迷宮購自成都泰盟儀器有限公司；RT-6100 型酶標儀購自美國Rayto 公司；164-5070 型蛋白電泳儀、Chemi XRS+型凝膠成像系統購自美國BioRad 公司；EMUC7FC7型冷凍超薄切片機購自德國Leica公司；Axio Observe A1 型倒置相差熒光顯微鏡購自德國Zeiss公司等。

2 方法

2.1 分組、給藥與造模

大鼠適應性飼養2周后開始實驗。將大鼠隨機分為對照組、模型組、PNU-282987 組和MLA+PNU-282987組，每組15 只。除對照組外，其余各組大鼠均復制TLE模型，具體參考文獻[11]方法：先腹腔注射氯化鋰（127 mg/kg）24 h后，再腹腔注射東莨菪堿（1 mg/kg）以阻斷腹腔注射毛果蕓香堿的外周膽堿能效應；注射東莨菪堿30 min 后，腹腔注射毛果蕓香堿（35 mg/kg）。觀察大鼠癲癇發作情況，按照Racine 標準判斷癲癇發作程度，當其發生癲癇的級別超過Ⅳ級，持續時間超過1 h時，表明造模成功。隨即給藥，其中，PNU-282987組大鼠腹腔注射3 mg/kg PNU-282987[10]（臨用時以生理鹽水溶解）；MLA+PNU-282987組大鼠先腹腔注射6 mg/kg MLA（劑量根據前期預實驗結果設置，臨用時以生理鹽水溶解）阻斷α7nAChR，30 min 后再腹腔注射3 mg/kg PNU-282987；對照組與模型組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。腹腔注射時間統一在每天上午9：00，每天1次，連續2周。

2.2 大鼠癲癇發作行為觀察

連續給藥2 周后，觀察大鼠癲癇發作行為并根據Racine標準對其進行評分，記錄大鼠癲癇發作持續時間。

2.3 大鼠認知功能檢測

末次給藥后的第2 天，采用Morris 水迷宮實驗檢測各組大鼠認知水平，整個測試時間為6 d，每天測試2次。其中，第1～5 天為定位航行實驗：將大鼠分別從4 個不同象限面向池壁放入水中，記錄其在60 s內從入水到找到逃生平臺所需要的時間，即逃避潛伏期；若在60 s 內沒有找到平臺，逃避潛伏期時間記為60 s。將大鼠放在逃生平臺上停留20 s，增加大鼠對逃生平臺的記憶力，然后進行下一象限測試。實驗第6天進行空間探索實驗：將逃生平臺撤掉，將大鼠從逃生平臺所在對面象限放入水池，自由游泳60 s，記錄大鼠在平臺象限停留的時間以及穿越平臺的次數。

2.4 大鼠海馬組織CA1區神經元病理學形態觀察

采用Nissl 染色法進行觀察。Morris 水迷宮實驗結束后，每組隨機選擇5只大鼠麻醉并采用左心室灌流，斷頭取全腦，于4%多聚甲醛溶液中固定12 h；經脫水、包埋、切片后，取部分切片（剩余部分進行IBA-1陽性表達的檢測）進行Nissl染色；以95%乙醇脫水，二甲苯透明5 min，封片；采用光學顯微鏡觀察大鼠海馬組織CA1區神經元的病理學形態。

2.5 大鼠海馬組織中TNF-α、IL-6、IL-1β水平的檢測

采用ELISA 法進行檢測。每組隨機選擇5 只大鼠立即斷頭處死，快速取腦組織并分離兩側海馬，用冰生理鹽水沖洗表面，稱取海馬組織質量；用剪刀將海馬組織剪碎，加入RIPA 裂解液，并使用超聲研磨機磨碎，以15 000 r/min離心15 min，吸取上清液。嚴格參照ELISA試劑盒說明書方法檢測大鼠海馬組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

2.6 大鼠海馬組織中IBA-1陽性表達細胞的檢測

采用免疫熒光染色法進行檢測。選取“2.4”項下的冰凍切片，室溫下放置30 min，以PBS 緩沖液洗3 遍（每次5 min），滴加封閉液（5%BSA+0.3%TritonX-100），在37 ℃恒溫培養箱中孵育1 h；甩去多余封閉液，滴加IBA-1 一抗（稀釋度為1∶500），于4 ℃孵育過夜；以PBS洗滌3次（每次5 min）并吸干液體，滴加Alexa Fluor 594標記的二抗（稀釋度為1∶200），室溫下孵育1 h；以PBS避光沖洗3 次（每次5 min），滴加DAPI 復染細胞核后室溫下避光孵育10 min，沖洗后用抗熒光淬滅劑封片；采用倒置相差熒光顯微鏡觀察并采集圖像，通過圖像分析軟件計數每平方毫米中的IBA-1陽性細胞數量。

2.7 大鼠海馬組織中α7nAChR/NF-κB 信號通路相關蛋白表達水平的檢測

采用Western blot 法進行檢測。每組隨機選擇5 只大鼠，按“2.5”項下方法收集大鼠海馬組織的上清液，按BCA法計算上清液中的蛋白濃度；在等量目標蛋白中加入緩沖液，煮沸，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，加入封閉液在4 ℃下封閉過夜；加入α7nAChR、NF-κB p65、p-NF-κB p65 一抗（稀釋度分別為1∶500、1∶1 000、1∶500），于4 ℃下孵育過夜；以TBST 緩沖液洗膜，加入二抗（稀釋度為1∶5 000），常溫下孵育50 min；以TBST 緩沖液洗膜，ECL 發光液顯影，成像，使用Quantity One 軟件對目的蛋白的灰度值進行分析，并計算目的蛋白灰度值與內參蛋白（GAPDH）灰度值的比值，以表示目的蛋白的表達水平。

2.8 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 PNU-282987對TLE模型大鼠癲癇發作行為的影響

對照組大鼠無癲癇發作。與對照組比較，模型組大鼠癲癇評分及發作持續時間均顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，PNU-282987 組大鼠上述指標均顯著減少（P＜0.05）；與PNU-282987 組比較，MLA+PNU-282987組大鼠上述指標均顯著增加（P＜0.05），且與模型組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表1。

表1 各組大鼠癲癇發作行為和空間探索實驗結果（±s，n＝15）

表1 各組大鼠癲癇發作行為和空間探索實驗結果（±s，n＝15）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與PNU-282987組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組PNU-282987組MLA+PNU-282987組癲癇評分/分0 4.25±0.48a 1.37±0.23b 4.02±0.41c癲癇發作持續時間/s 0 146.38±17.36a 80.19±10.12b 140.25±15.23c原平臺象限停留時間/s 48.76±5.14 25.19±3.12a 37.23±3.36b 29.33±2.82c穿過平臺次數/次7.26±0.74 1.96±0.13a 5.21±0.48b 2.26±0.32c

3.2 PNU-282987對TLE模型大鼠認知功能的影響

與對照組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長（P＜0.05），原平臺象限停留時間及穿越平臺次數均顯著減少（P＜0.05）；與模型組比較，PNU-282987 組大鼠逃避潛伏期時間顯著縮短（P＜0.05），原平臺象限停留時間及穿越平臺次數均顯著增加（P＜0.05）；與PNU-282987 組比較，MLA+PNU-282987 組大鼠逃避潛伏期時間顯著延長（P＜0.05），原平臺象限停留時間及穿越平臺次數均顯著減少（P＜0.05），且與模型組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表1、表2。

表2 各組大鼠逃避潛伏期的檢測結果（±s，n＝15，s）

表2 各組大鼠逃避潛伏期的檢測結果（±s，n＝15，s）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與PNU-282987組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組PNU-282987組MLA+PNU-282987組第1天40.97±4.37 59.38±6.14a 50.28±4.89b 57.29±5.36c第2天35.74±3.84 52.03±6.68a 42.30±4.17b 51.68±5.01c第3天30.64±2.75 45.16±8.39a 36.13±3.29b 40.81±4.27c第4天21.68±3.11 36.09±6.57a 27.42±2.35b 33.28±3.16c第5天15.26±1.62 30.64±4.43a 20.22±2.71b 28.15±2.54c

3.3 PNU-282987 對TLE 模型大鼠海馬組織CA1 區神經元病理學形態的影響

對照組大鼠海馬組織細胞質中尼氏小體豐富且神經元排列整齊，形態完整。模型組大鼠海馬組織細胞質中尼氏小體明顯減少且神經元排列紊亂，部分細胞水腫，呈現空泡變性壞死，細胞結構不完整。經PNU-282987處理后，大鼠海馬組織細胞質中尼氏小體明顯增多，神經元排列致密，空泡變性壞死減少，損傷程度明顯減輕。經MLA 阻斷α7nAChR 后，PNU-282987 對癲癇大鼠海馬神經元的保護作用被逆轉。結果見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織CA1區神經元的Nissl染色圖

3.4 PNU-282987 對TLE 模型大鼠海馬組織中炎癥因子水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠海馬組織中TNF-α、IL-6和IL-1β 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，PNU-282987 組大鼠海馬組織中上述指標水平均顯著降低（P＜0.05）；與PNU-282987 組比較，MLA+PNU-282987組上述指標水平均顯著升高（P＜0.05），且與模型組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表3。

表3 各組大鼠海馬組織中炎癥因子水平的檢測結果（±s，n＝5，pg/mL）

表3 各組大鼠海馬組織中炎癥因子水平的檢測結果（±s，n＝5，pg/mL）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與PNU-282987組比較，P＜0.05。

IL-1β 30.08±2.76 108.56±9.16a 61.74±5.48b 107.65±9.39c組別對照組模型組PNU-282987組MLA+PNU-282987組TNF-α 48.26±5.14 115.16±10.53a 79.58±6.89b 110.25±10.53c IL-6 40.13±4.21 84.35±7.99a 68.71±6.75b 80.11±7.84c

3.5 PNU-282987 對TLE 模型大鼠海馬組織中IBA-1陽性表達細胞的影響

與對照組[（10.36±2.97）個/mm2]比較，模型組大鼠海馬組織中IBA-1陽性細胞數量[（56.89±8.32）個/mm2]顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，PNU-282987組大鼠海馬組織中IBA-1陽性細胞數量[（23.18±1.97）個/mm2]顯著降低（P＜0.05）；與PNU-282987 組比較，MLA+PNU-282987 組大鼠海馬組織中IBA-1 陽性細胞數量[（52.12±7.14）個/mm2]顯著增加（P＜0.05），且與模型組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見圖2。

圖2 各組大鼠海馬組織中IBA-1陽性表達細胞的熒光圖

3.6 PNU-282987對TLE模型大鼠海馬組織中α7nAChR/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠海馬組織中α7nAChR表達水平顯著降低，NF-κB p65、p-NF-κB p65 表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，PNU-282987 組大鼠海馬組織中上述指標表達水平均顯著逆轉（P＜0.05）；與PNU-282987 組比較，MLA+PNU-282987 組大鼠海馬組織中上述指標表達水平均顯著逆轉（P＜0.05），且與模型組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見圖3、圖4。

圖3 各組大鼠海馬組織中α7nAChR/NF-κB信號通路相關蛋白表達的電泳圖

圖4 各組大鼠海馬組織中α7nAChR/NF-κB信號通路相關蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝5）

4 討論

TLE為成年人中發病率最高的一種癲癇，占難治性癲癇的一半以上[12]。TLE患者通常伴有嚴重的認知功能障礙，臨床上首選抗癲癇藥物治療[13]。但傳統藥物只能控制癲癇發作癥狀，且伴有嚴重的副作用，因此，積極開發治療新藥非常重要。神經炎癥反應可能與癲癇的發病機制之間存在復雜的網絡關系[4]，尋找靶向神經炎癥通路的藥物可為癲癇的治療提供新方法。

小膠質細胞作為神經系統的主要免疫效應細胞，其介導的神經炎癥反應在癲癇的發展中起關鍵作用[14]。有文獻指出，繼發性癲癇患者中活化小膠質細胞數量明顯增加[15]，并且癲癇發作持續時間以及頻率與小膠質細胞的活化程度明顯相關[16]。激活的小膠質細胞有M1和M2 兩種表型，其中M1 型小膠質細胞主要分泌TNF-α、IL-6等促炎因子，促進神經炎癥反應，加重神經損傷；M2型小膠質細胞主要分泌IL-10、轉化生長因子β等抗炎因子，抑制神經炎癥反應，發揮神經保護作用[17]。α7nAChR為煙堿受體中的一種亞型，是由5 個α7 亞基構成的同源多聚體，在海馬小膠質細胞上有大量分布[6]。活化的α7nAChR 可減輕小膠質細胞在腦組織中引起的炎癥反應及神經損傷[18]，因此，本研究以特異性α7nAChR 激動劑PNU-282987 干預TLE 模型大鼠，并通過觀察大鼠癲癇發作以及Morris水迷宮實驗對PNU-282987的藥效進行評價。結果顯示，PNU-282987 可抑制模型大鼠癲癇發作并改善其學習記憶水平，但該作用能夠被MLA所逆轉，說明PNU-282987發揮作用的機制與α7nAChR有關。

海馬是研究癲癇伴隨學習記憶障礙最合適的腦區[19]。一方面，海馬與癲癇的發生、發展緊密聯系，尤其是CA1 區、CA3 區是癲癇研究的常見區域[20]。另一方面，海馬又是大腦中負責長期學習記憶能力、空間定位等認知功能的區域[21]。反復的癲癇發作會導致海馬受損，降低海馬信息處理的突觸可塑性，引起長期記憶功能障礙[22]。本研究結果顯示，以PNU-282987干預后，大鼠海馬神經元損傷程度明顯減輕，這說明PNU-282987對TLE 模型大鼠海馬神經元具有保護作用。為進一步分析PNU-282987是否通過逆轉小膠質細胞激活來減輕中樞炎癥反應，本研究還檢測了小膠質細胞標志蛋白IBA-1（其表達量直接反映小膠質細胞的活化程度[23]）以及炎癥因子的表達。結果顯示，經PNU-282987干預后，TLE模型大鼠海馬組織中IBA1、TNF-α、IL-6和IL-1β的表達均降低，并且該作用被MLA 逆轉，這說明PNU-282987可通過激活α7nAChR，抑制小膠質細胞激活，進而減輕TLE模型大鼠海馬組織內的炎癥反應。

α7nAChR 活化后的抗炎作用與NF-κB 密切相關，NF-κB作為一種細胞內廣泛表達的轉錄調節因子，其激活是炎癥反應復雜細胞因子網絡中的關鍵環節[24]。Lei等[25]研究發現α7nAChR介導的CAP分子機制主要歸因于NF-κB 轉錄。因此，CAP 將通過α7nAChR 介導細胞內信號通路抑制NF-κB 核移位，減少細胞因子的表達，達到抗炎作用[26]。本研究結果顯示，以PNU-282987 干預后，模型大鼠海馬組織中α7nAChR表達升高，NF-κB表達降低，且該作用可被MLA逆轉，這說明PNU-282987可通過激活海馬組織中小膠質細胞上的α7nAChR，下調NF-κB表達。

綜上所述，PNU-282987 可改善TLE 模型大鼠的認知功能障礙，其機制可能是通過激活α7nAChR/NF-κB信號通路，抑制小膠質細胞介導的炎癥反應，進而減輕海馬神經元損傷。