高良姜素促進骨質疏松模型大鼠骨折愈合的機制研究Δ

吳永鐵，申雄成[遵義市第一人民醫院（遵義醫科大學第三附屬醫院）骨科二病區，貴州 遵義 563000]

骨質疏松（osteoporosis，OP）是一種以低骨量和骨組織微結構破壞為特征的常見老年疾病，因其易導致骨脆性增加和骨折的發生，所以OP患者的致殘率較高[1]。目前臨床上用來治療OP 的藥物多以雌激素類藥物為主，但其會對人體產生不同程度的副作用[2]。因此，積極開發新的安全有效、副作用小的抗OP 天然活性成分顯得尤為重要。高良姜素（galangin，Gal）是一種天然的類黃酮化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗糖尿病和神經保護等多種藥理活性[3]。Gal可以減緩軟骨細胞外基質降解，改善骨關節炎進展，可能是治療骨關節炎的潛在候選藥物[4]。據報道，Gal 可誘導人骨肉瘤MG-63 和U-2OS 細胞的成骨分化[5]。也有報道稱，Gal可以通過抑制絲裂原激活蛋白激酶（mitogen activation protein kinase，MAPK）和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路抑制破骨細胞形成，從而有效抑制OP 的發展[6]。缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）/血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）介導的血管生成在骨折愈合中發揮重要作用。研究表明，HIF-1α/VEGF信號通路被激活后，HIF-1α活性增強，VEGF表達升高，可促進血管生成，預防骨質流失，最終增強骨折愈合[7—8]。但Gal 是否能通過調節HIF-1α/VEGF 信號通路促進OP 模型大鼠骨折愈合尚不清楚。因此，本研究基于HIF-1α/VEGF信號通路探討Gal對OP模型大鼠骨折愈合的影響及可能的作用機制，以期為臨床治療OP 提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有HBS-ScanX 型多功能全自動酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）、μCT-100型微計算機斷層掃描（micro-computed tomography，micro-CT）設備（丹東奧龍射線儀器集團有限公司）、CX31型光學顯微鏡（日本Olympus公司）、EPS-300型電泳儀（上海天能科技有限公司）、DW-86L348型超低溫冰箱（青島澳柯瑪股份有限公司）、BSA124S/BSA224S 型分析天平（德國Sartorius公司）。

1.2 主要藥品與試劑

Gal對照品（批號LA1806，純度≥98%）購自北京康瑞納生物科技有限公司；PX-478（HIF-1α/VEGF 信號通路抑制劑，批號M00231-CVW）購自北京百奧萊博科技有限公司；骨鈣素（osteocalcin，OCN）、Ⅰ型膠原交聯C末端肽（C-terminal telopeptides of type Ⅰ collagen，CTX-Ⅰ）、骨形態發生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號分別為E-EL-R0243c 、E-EL-R1456c、E-EL-R0002c）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；蛋白提取試劑盒（批號YT8951）購自北京伊塔生物科技有限公司；兔源堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、HIF-1α、VEGF、血小板內皮細胞黏附分子1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一 抗（批 號 分 別 為ab83259、ab179483、ab214424、ab222783、ab9485）以及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（批號ab6721）均購自美國Abcam公司。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF 級健康雌性SD 大鼠，共72只，8～10 周齡，體重180～200 g，購自貴州醫科大學實驗動物中心，生產許可證號為SCXK（黔）2018-0001。大鼠飼養環境溫度為22 ℃，濕度為55%～60%，12 h 光暗循環，飼養期間自由攝食和飲水。適應性喂養1周后進行實驗。本研究獲得了本院倫理委員會的批準，批準號為倫審（2022）-2-08號。

2 方法

2.1 動物建模、分組與給藥

取72 只大鼠分為造模組（n＝60）和假手術（Sham）組（n＝12）。造模組大鼠采用雙側卵巢切除手術構建OP大鼠模型，具體操作如下：對造模組大鼠行雙側卵巢切除術，卵巢切除后縫合傷口。12 周后利用小動物micro-CT 檢測造模大鼠的腰椎骨密度（bone mineral density，BMD），當造模組大鼠BMD與Sham組相比顯著降低時，即表明OP大鼠造模成功。腹腔注射3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉大鼠，鋼鋸橫向切斷股骨中段，并用克氏針在髓腔內固定，縫合切口，以構建骨折模型，具體操作參考文獻[9]。Sham組大鼠僅在卵巢周圍結扎并切除相當大小的脂肪組織。將造模成功的60 只大鼠按照隨機數字表法分成模型（Model）組和Gal低、中、高劑量組以及抑制劑組（HIF-1α/VEGF 信號通路抑制劑PX-478），每組12 只。Gal 低、中、高劑量組腹腔注射2.5、5、10 mg/kg 的Gal[6]，抑制劑組腹腔注射10 mg/kg 的Gal 和100 mg/kg 的PX-478[10]，Sham 組和Model 組腹腔注射等量生理鹽水；每天1次，連續90 d。

2.2 大鼠股骨顯微結構分析

各組取6 只大鼠麻醉處死，取出兩側股骨，漂洗干凈，進行micro-CT。使用VGStudio Max 2.2 軟件定量分析，獲得BMD、骨體積分數（bone volume/total volume，BV/TV）、骨小梁數（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）。

2.3 大鼠股骨生物力學檢測

將“2.2”項下大鼠左側股骨水平放在跨度為20 mm的測試儀器的2 個支撐點上，以10 mm/min 的速率下壓探頭，至股骨中段斷裂，利用儀器自帶軟件分析得到骨生物力學指標最大負載。

2.4 大鼠骨組織損傷及新生血管情況檢測

采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察骨組織損傷及新生血管情況。取“2.2”項下大鼠的右側股骨骨折處骨痂組織，經多聚甲醛固定、乙二胺四乙酸脫鈣、梯度乙醇脫水、包埋切片（厚度為5 μm）、脫蠟和水化后進行HE 染色，最后在顯微鏡下觀察大鼠骨組織損傷并分析新生血管數量和面積。

2.5 大鼠股骨中PECAM-1表達情況檢測

采用免疫熒光染色法檢測大鼠股骨中PECAM-1表達。取“2.2”項下大鼠左側股骨，經固定、脫鈣、包埋切片（5 μm）、磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗后加入PECAM-1 一抗，4 ℃避光孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 二抗，室溫下避光孵育1 h，經PBS 洗滌、DAPI 避光復染5 min、封片后，采用熒光顯微鏡觀察并拍攝照片。采用Image J軟件計算PECAM-1的平均熒光強度。

2.6 大鼠血清中OCN、CTX-Ⅰ、BMP-2含量測定

采用ELISA 法進行檢測。取每組剩余的6 只大鼠的腹主動脈血，以3 000 r/min離心15 min，取上層血清，根據試劑盒說明書方法檢測大鼠血清中OCN、CTX-Ⅰ、BMP-2的含量。

2.7 大鼠骨痂組織中ALP、HIF-1α、VEGF 蛋白表達檢測

采用Western blot法進行檢測。麻醉處死“2.6”項下取血后的大鼠，提取其骨痂組織中的總蛋白，通過BCA法測定總蛋白濃度。將蛋白高溫變性，取120 μg變性蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（電壓120 V，電泳時間60 min），轉膜（電流250 mA，轉膜時間60 min），以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；分別加入ALP（稀釋比例1∶1 000）、HIF-1α（稀釋比例1∶2 000）、VEGF（稀釋比例1∶1 000）、GAPDH（稀釋比例1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過夜；洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（稀釋比例1∶2 000），室溫孵育90 min；洗膜后，采用ECL 發光顯影。以Image J 軟件分析蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

2.8 統計學方法

實驗數據用GraphPad Prism 9.0 軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 Gal對大鼠股骨顯微結構的影響

與Sham 組比較，Model 組大鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 均顯著降低（P＜0.05）；與Model 組比較，Gal低、中、高劑量組大鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均顯著升高（P＜0.05），且具有明顯的劑量依賴性；與Gal 高劑量組比較，抑制劑組大鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖1、表1。

圖1 各組大鼠股骨Micro-CT結果

表1 各組大鼠股骨顯微結構指標的比較（±s，n＝6）

表1 各組大鼠股骨顯微結構指標的比較（±s，n＝6）

a：與Sham組比較，P＜0.05；b：與Model組比較，P＜0.05；c：與Gal低劑量組比較，P＜0.05；d：與Gal中劑量組比較，P＜0.05；e：與Gal高劑量組比較，P＜0.05。

BMD/（mg/cm3）252.38±24.65 156.31±14.87a 174.08±15.49b 204.31±18.36bc 235.62±19.72bcd 185.93±16.54e Tb.Th/μm 57.96±4.98 43.28±3.51a 46.73±4.68b 51.48±4.73bc 55.93±4.21bcd 46.85±3.94e組別Sham組Model組Gal低劑量組Gal中劑量組Gal高劑量組抑制劑組BV/TV/%46.58±3.91 31.74±3.17a 34.56±3.58b 38.94±3.84bc 43.16±3.76bcd 35.89±3.29e Tb.N/（1/mm）3.98±0.75 2.25±0.53a 2.76±0.49b 3.29±0.57bc 3.76±0.61bcd 2.85±0.48e

3.2 Gal對大鼠股骨生物力學的影響

與Sham 組[（49.48±3.76） N]比較，Model 組大鼠股骨最大負載[（23.68±2.59） N]顯著降低（P＜0.05）；與Model 組比較，Gal 低、中、高劑量組大鼠股骨最大負載[分別為（27.36±2.84）、（32.54±3.17）、（37.83±3.69） N]均顯著升高（P＜0.05），且具有明顯的劑量依賴性；與Gal 高劑量組比較，抑制劑組大鼠股骨最大負載[（28.46±2.75） N]顯著降低（P＜0.05）。

3.3 Gal對大鼠骨組織病理損傷的影響

Sham組大鼠骨組織中骨小梁數量多、較粗、致密分布；與Sham 組比較，Model 組大鼠骨組織中骨小梁數量減少、變薄、間隙增大、結構較亂和疏松，新生血管數量和血管面積均顯著減少/減小（P＜0.05）；與Model 組比較，Gal 低、中、高劑量組大鼠骨組織中骨小梁數量和厚度明顯改善、間距減小、結構更密集、排列整齊，新生血管數量和血管面積均顯著增多/增大（P＜0.05），且具有明顯的劑量依賴性；與Gal高劑量組比較，抑制劑組大鼠骨組織中骨小梁數量減少、變細、間距增大、結構較為疏松，新生血管數量和血管面積均顯著減少/減小（P＜0.05）。結果見圖2和表2。

圖2 各組大鼠骨組織的HE染色顯微圖

表2 各組大鼠新生血管數量、血管面積和PECAM-1表達的比較（±s，n＝6）

表2 各組大鼠新生血管數量、血管面積和PECAM-1表達的比較（±s，n＝6）

a：與Sham組比較，P＜0.05；b：與Model組比較，P＜0.05；c：與Gal低劑量組比較，P＜0.05；d：與Gal中劑量組比較，P＜0.05；e：與Gal高劑量組比較，P＜0.05。

血管面積/μm2 6 987.42±418.71 2 346.58±276.39a 2 965.90±293.46b 3 817.94±323.18bc 5 352.64±358.76bcd 2 649.38±287.41e PECAM-1平均熒光強度21.36±1.65 3.21±0.46a 7.58±0.62b 12.96±1.28bc 19.21±1.57bcd 5.23±0.64e組別Sham組Model組Gal低劑量組Gal中劑量組Gal高劑量組抑制劑組新生血管數量/個19.04±1.37 7.68±0.98a 9.84±1.02b 12.79±1.13bc 15.94±1.25bcd 10.43±1.10e

3.4 Gal對大鼠股骨中PECAM-1表達的影響

與Sham 組比較，Model 組大鼠股骨中PECAM-1 平均熒光強度顯著降低（P＜0.05）；與Model 組比較，Gal低、中、高劑量組大鼠股骨中PECAM-1平均熒光強度均顯著升高（P＜0.05），且具有明顯的劑量依賴性；與Gal高劑量組比較，抑制劑組大鼠股骨中PECAM-1 平均熒光強度顯著降低（P＜0.05）。結果見圖3、表2。

圖3 各組大鼠股骨中PECAM-1表達的免疫熒光圖

3.5 Gal 對大鼠血清中OCN、CTX-Ⅰ、BMP-2 含量的影響

與Sham 組比較，Model 組大鼠血清中OCN、BMP-2含量均顯著降低（P＜0.05），CTX-Ⅰ含量顯著升高（P＜0.05）；與Model組比較，Gal低、中、高劑量組大鼠血清中OCN、BMP-2 含量均顯著升高（P＜0.05），CTX-Ⅰ含量均顯著降低（P＜0.05），且具有明顯的劑量依賴性；與Gal 高劑量組比較，抑制劑組大鼠血清中OCN、BMP-2含量均顯著降低（P＜0.05），CTX-Ⅰ含量顯著升高（P＜0.05）。結果見表3。

表3 各組大鼠血清中OCN、CTX-Ⅰ、BMP-2含量的比較（±s，n＝6，ng/mL）

表3 各組大鼠血清中OCN、CTX-Ⅰ、BMP-2含量的比較（±s，n＝6，ng/mL）

a：與Sham組比較，P＜0.05；b：與Model組比較，P＜0.05；c：與Gal低劑量組比較，P＜0.05；d：與Gal中劑量組比較，P＜0.05；e：與Gal高劑量組比較，P＜0.05。

BMP-2 15.64±2.68 5.23±1.27a 7.11±1.45b 9.86±1.64bc 12.34±1.98bcd 8.23±1.47e組別Sham組Model組Gal低劑量組Gal中劑量組Gal高劑量組抑制劑組OCN 19.14±3.85 8.43±1.63a 10.45±2.07b 13.56±2.31bc 15.87±2.68bcd 11.54±2.37e CTX-Ⅰ27.58±3.21 42.83±4.87a 39.14±4.52b 35.21±3.65bc 31.45±3.43bcd 40.56±4.37e

3.6 Gal 對大鼠骨痂組織中ALP、HIF-1α、VEGF 蛋白表達的影響

與Sham 組比較，Model 組大鼠骨痂組織中ALP、HIF-1α、VEGF 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）；與Model 組比較，Gal 低、中、高劑量組大鼠骨痂組織中ALP、HIF-1α、VEGF 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05），且具有明顯的劑量依賴性；與Gal高劑量組比較，抑制劑組大鼠骨痂組織中ALP、HIF-1α、VEGF蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖4、表4。

圖4 各組大鼠骨痂組織中ALP、HIF-1α、VEGF 蛋白表達的電泳圖

表4 各組大鼠骨痂組織中ALP、HIF-1α、VEGF 蛋白表達水平比較（±s，n＝6）

表4 各組大鼠骨痂組織中ALP、HIF-1α、VEGF 蛋白表達水平比較（±s，n＝6）

a：與Sham組比較，P＜0.05；b：與Model組比較，P＜0.05；c：與Gal低劑量組比較，P＜0.05；d：與Gal中劑量組比較，P＜0.05；e：與Gal高劑量組比較，P＜0.05。

VEGF/GAPDH 1.67±0.18 0.29±0.03a 0.60±0.07b 0.94±0.08bc 1.42±0.13bcd 0.37±0.04e組別Sham組Model組Gal低劑量組Gal中劑量組Gal高劑量組抑制劑組ALP/GAPDH 1.86±0.21 0.31±0.02a 0.67±0.07b 1.15±0.10bc 1.65±0.15bcd 0.72±0.09e HIF-1α/GAPDH 1.47±0.12 0.36±0.04a 0.69±0.08b 1.08±0.10bc 1.35±0.12bcd 0.53±0.05e

4 討論

OP是全身性代謝性骨病，隨著年齡的增長，發病率在逐漸升高，尤其在絕經后的女性中表現得更加明顯；OP 與骨痂形成、骨生長減少、骨密度降低、生物力學強度降低以及骨折愈合過程中細胞分化延遲有關[1—2]。因此，積極探索安全有效的促進骨折愈合的藥物對臨床治療OP具有重要意義。本研究采用雙側卵巢切除手術構建OP 大鼠模型，對其進行研究發現，Model 組大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 均降低，股骨顯微結構顯著受損，最大負載顯著下降，生物力學強度降低，與前人研究結果一致[9]，提示OP模型大鼠構建成功。

黃酮類化合物作為一大類天然化合物，普遍存在于食物和植物中，并且可通過調節不同途徑來影響OP。例如蘆丁通過調節蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路，抑制絕經后的OP[11]；槲皮素通過G 蛋白偶聯受體C族6成員A/AMP活化蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路調節葡萄糖和脂質代謝來減輕小鼠睪丸切除術后的OP[12]。Gal 是一種天然黃酮類化合物，也是高良姜的主要活性成分，因其對骨骼相關疾病顯示出良好的藥理活性而備受關注。Gal通過減弱NFκB受體激活蛋白配體活性，誘導Jun激酶和NF-κB途徑的激活，進而防止破骨細胞前體和膠原蛋白誘導的關節炎模型小鼠的骨破壞[13]。Gal可上調人羊膜間充質干細胞中早期成骨細胞特異性標志物（即ALP、Runt 相關轉錄因子2 蛋白、成骨細胞特異性轉錄因子Osterix）以及晚期成骨細胞特異性標志物（Ⅰ型膠原α1鏈蛋白、骨橋蛋白和OCN）的mRNA和蛋白表達，促進人羊膜間充質干細胞的成骨分化[14]。Gal通過激活富含脯氨酸/精氨酸的亮氨酸末端重復蛋白，在體內外顯著改善骨關節炎的進展[4]。Li 等[6]研究還表明，Gal 可通過調節胞外信號調節激酶和NF-κB 途徑，抑制破骨形成來抑制OP。但目前Gal 對OP 模型大鼠骨折愈合的影響尚不清楚。本研究發現，Gal 可減輕OP 模型大鼠股骨顯微結構損傷，提高骨密度，增加最大負載，改善骨生物力學性能，升高血清中OCN 和BMP-2 含量，上調ALP 蛋白表達，并降低CTX-Ⅰ含量。ALP可在一定程度上反映細胞礦化及成骨分化的能力[14]。OCN是骨中最豐富的非膠原蛋白，也是成骨分化過程中晚期階段的標志性物質，在成骨細胞中特異性表達，維持骨重建、吸收和礦化[15]。BMP-2 參與調節成骨細胞分化，是軟骨和骨形成的主要誘導因子[15]。CTX-Ⅰ是骨Ⅰ型膠原的降解產物，可作為骨吸收的標志物[15]。這提示，Gal可能是通過調節骨代謝，抑制去卵巢OP模型大鼠骨流失，促進骨折愈合，從而發揮抗大鼠OP的作用。

骨是一種高度血管化的組織，其廣泛的血管和毛細血管網絡，可為骨的形成和發育提供氧氣和營養，血管生成在OP過程中起著至關重要的作用[16]。骨微環境中的血管生成是骨骼生長發育、骨折后修復和維持骨骼健康所必需的，OP 或骨質減少患者的血液供應量相對低于骨量正常的人，表明骨血液供應與骨礦物質密度高度相關[17]。因此，激活骨微環境中的血管生成可能是預防OP的重要策略。HIF1-α信號通路的激活增加了骨血管的形成，并參與了骨重塑；成骨細胞中HIF1-α基因的敲除導致骨血管化和成骨減少；成骨細胞中HIF1-α信號通路的激活不僅可以抑制雌激素缺乏引起的骨質流失，還可以促進骨形成和血管生成[18—19]。VEGF是HIF1-α的下游基因，成骨細胞分化過程中VEGF 的表達增加，可促進血管生成、骨形成和重塑[18—19]。PECAM-1廣泛分布于血管內皮細胞中，主要參與血管形成等生理活動，可作為評估血管形成的標記分子[20]。本研究發現，在OP模型大鼠中PECAM-1、HIF-1α和VEGF蛋白表達降低，OP 模型大鼠的血管數量和血管面積也顯著減少/減小；Gal 可促進PECAM-1、HIF-1α 和VEGF 蛋白表達，增加血管數量和血管面積。而使用HIF1-α/VEGF 信號通路抑制劑后，大鼠血管數量和血管面積減少，減弱了Gal對OP模型大鼠的骨折愈合促進作用。這提示，Gal可通過HIF1-α/VEGF 信號通路調節骨代謝，改善OP 模型大鼠骨密度，促進骨折愈合。

綜上所述，Gal 可調節骨代謝，改善OP 模型大鼠骨密度，促進骨折愈合；其作用機制可能與激活HIF1-α/VEGF 信號通路，促進血管生成有關。然而本研究尚存在不足之處，僅驗證了Gal對HIF1-α/VEGF信號通路的作用，未對其他靶點、途徑進行驗證，后續研究將會進一步明確Gal在OP中的作用機制。