柵藻Desmodesmus sp. SNN1 處理生活污水及油脂積累研究

王洪波王鵬沖牛旭東楊文龍陳高

(1.山東建筑大學市政與環境工程學院，山東 濟南 250101；2.山東省農業科學院農作物種質資源研究所，山東 濟南 250100；3.山東省作物遺傳改良與生理生態重點實驗室，山東 濟南 250100)

0 引言

目前，我國城鎮污廢水處理工藝主要為活性污泥法。 為達到較好的污水處理效果，針對不同污染物種類，需要結合較為復雜的處理工藝，這些處理工藝均存在設備占地面積大、運行費用高、過程管理復雜等缺點[1]。 污水處理過程中產生的剩余污泥的管理一直是水處理領域中的難題[2-3]，剩余污泥的處置費用也是水廠運行成本之一[4]。 我國生活污水處理主要采用一級污水處理作為預處理，二級污水處理作為主體的方式。 雖然經過二級處理，污水中的污染物有所降低，但是仍然無法有效地降低污水中的無機氮、磷。 經過處理的污水排放到水環境中仍然會造成水體中的氮、磷升高，從而引發水華、赤潮等危害。 因此，開發符合社會經濟和環境要求的友好水處理技術迫在眉睫。

微藻廢水處理技術是一種極具發展前景的廢水處理和養分回收技術，近年來受到廣泛關注。 目前，微藻已經在不同廢水的處理上取得了一定的成效，如工業廢水、市政廢水、農業廢水及畜牧養殖廢水等。 趙秀俠等[5]選取小球藻、柵藻和螺旋藻處理龜鱉養殖廢水，發現柵藻對養殖廢水的總氮(Total Nitrogen，TN)的去除率為93.65%，小球藻對總磷(Total Phosphorus，TP)的最大去除率為99.46%，而螺旋藻去除氨氮(-N)效果最好，去除率可達98.79%。 郝凱旋等[6]研究了菌藻系統、混合藻、活性污泥對二級出水中氮磷的去除，發現菌藻系統中菌株和微藻之間的協同作用在廢水處理方面有較強優勢，其對-N、P 的去除率分別為94.16%和83.30%。

污水處理過程中獲取的微藻細胞用途十分廣泛。 微藻細胞中含有油脂、蛋白質、糖類等，均可以作為化工、飼料、食品的原料。 微藻油脂產率高，是解決油脂來源的重要突破口，可認為是有潛力完全取代石油的生物質資源[7-8]，而且由于微藻具有較高的光合作用效率，成為有競爭力的生物柴油來源。生物柴油是一種可生物降解、可再生、無毒和CO2中性的能源[9]，具有與常規柴油燃料相似的特性[10]；但與常規柴油相比，生物柴油排放的CO、SO2或其他空氣污染物更少[9]。 大力發展生物柴油對經濟可持續發展、減輕環境壓力、控制城市空氣污染有著重要的戰略意義[11]。

優化柵藻SNN1 在生活污水中的培養條件，可以提高其生物質積累能力和去除化學需氧量(Chemical Oxygen Demand，COD)、-N、TN 和TP等營養物質的能力。 文章將微藻的生產和污水的凈化處理結合起來，既可培養微藻快速生長繁殖，又能吸收利用生活污水中的營養物質，為城市生活污水的處理與微藻的生物質生產提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

目標藻種柵藻Desmodesmussp. SNN1 是從山東建筑大學映雪湖湖泥中分離純化得到的。 生活污水來自山東建筑大學中水站初沉池進水，用于微藻的培養。 收集的污水僅通過定性濾紙抽濾，以去除較大的、不可溶的懸浮固體。 濾液不經高壓滅菌、減毒等其他處理直接投入使用。 原污水水質指標:COD為120 ～140 mg/L，-N 為80 ～90 mg/L，TN 為90～100 mg/L，TP 為3～5 mg/L，pH 為7.6～7.8。

1.2 培養條件

微藻的擴大培養均在BG-11 培養基中進行。特定接種量的藻株接種于裝有50 mL 生活污水的錐形瓶中培養。 光照培養箱中培養溫度為25 ～30 ℃，經24 h 通氣，并經光照培養12 d。 實驗光照強度為40 μmol/(m2·s)，每天定時搖晃藻瓶3 次。

1.3 實驗方法

1.3.1 生活污水初始pH 對處理效果的影響

生活污水初始pH 分別設置為6.0、7.0、8.0、9.0、空白對照組(原污水，pH＝7.8)。 向生活污水中添加一定量的1 mol/L 鹽酸和NaOH 溶液調節生活污水的pH，使用pH 計測量生活污水的pH。 每組實驗設置2 個平行樣。 初始藻液在680 nm 波長處的光密度(Optical Density at 680 nm，OD680)為0.2。 將藻株培養到不同pH 的生活污水中。 每兩天取一次樣，用于測定-N、COD、生物量、油脂比例和油脂產量。

1.3.2 不同起始接種量對微藻處理生活污水效果的影響

微藻以不同的初始OD680值接種于處理后的生活污水中，根據其生長情況及污水的處理情況，篩選出最合適的初始OD 值。 起始OD680值為0.1、0.2、0.4、0.6，每個OD 值設置2 個平行樣。 生活污水初始pH ＝9。 每兩天取一次樣，用于測定-N、生物量、COD、油脂比例和油脂產量。

1.4 分析方法

1.4.1 水質指標的測定

取樣時將樣品置于50 mL 離心管中，7 000 r/min離心10 min，上清液經0.45 mm 孔徑濾膜抽濾去除藻細胞，濾液用于污水水質指標的測定。 測定方法參照中國國家標準監測方法[12]，其中TN、-N、TP、COD 分別采用過硫酸鉀消解紫外分光光度法、納氏試劑分光光度法、過硫酸鉀消解鉬酸銨比色法、重鉻酸鉀法測定。 TN、-N、TP 和COD 去除率的計算由式(1)表示為

式中R為去除率，%；C0、Ct分別為初始、t時刻的質量濃度，mg/L。

1.4.2 生物質指標的測定

(1) 生物量

采用測量微藻細胞干重來測定污水中微藻生物量。 藻細胞干重測量方法:用烘干后的2 mL 離心管裝2 mL 待測藻液，12 000 r/min 離心10 min，棄去上清液，放入60 ℃烘箱，烘干至恒重并稱重，干重由式(2)表示為

式中M為微藻干重，g/L；m1為烘干前離心管的質量，g；m0為烘干后離心管以及藻的質量，g；V為測量干重所用的藻液體積，L。

(2) 油脂

采用改進氯仿-甲醇法[13]進行測定，每天相同時間取30 mL 藻液于50 mL 離心管中。 將離心管放入離心機中，以7 000 r/min 離心10 min，離心結束后快速倒掉上清液，得到提取油脂藻泥。 加入500 μL的1 mol/L 鹽酸，在渦漩振蕩器上振蕩搖勻，對微藻進行破壁處理，隨后在通風櫥中加入氯仿和甲醇(體積比2∶1)萃取溶液提取油脂。 將離心管避光置于搖床上，以150 r/min 的速度進行4 h 的振蕩反應，使之充分混合。 離心后向試管中加入10 mL生理鹽水，于渦漩振蕩器上振蕩60 s 后，再以7 000 r/min轉速離心10 min。 離心后在通風櫥內用注射器將最下層氯仿、甲醇和油脂的混合溶液抽取至烘干后的錫紙盒中，并將錫紙盒放入通風櫥中直至氯仿、甲醇全部揮發，再將錫紙盒放入60 ℃烘箱中，烘至恒重。

油脂產量由式(3)和(4)分別表示為

式中C為油脂產量，g/L；M0為烘干后錫紙盒的質量，g；M1為烘干后錫紙盒以及油脂質量，g；η為油脂比例，%。

2 結果與分析

2.1 初始pH 對柵藻SNN1 處理生活污水及生物質積累的影響

2.1.1 初始pH 對柵藻SNN1 處理生活污水的影響

不同初始pH 對柵藻SNN1 處理生活污水效果的影響如圖1 所示。 柵藻SNN1 對不同初始pH 生活污水中COD 的去除效果如圖1(a)所示。 在0 ～4 d時，不同初始pH 的生活污水中COD 有一定程度的下降；在4～12 d 時，COD 基本保持穩定。 隨著初始pH 的升高，柵藻SNN1 對生活污水中COD 的去除效果也在逐漸增強。 pH ＝6.0 時，生活污水中的COD 由137.27 mg/L 降至87.16 mg/L；pH ＝9.0 時，COD 降至72.85 mg/L，去除率高達46.93%，高于其他實驗組。 造成這種情況的原因可能是柵藻SNN1在較高的pH 中會有較好的生物活性，代謝能力更強，會去除較多的COD；在較低的pH 中代謝活動減弱，生長能力差，去除量減少。 但COD 的脫除效率依然較低，是因為生活污水中的有機物主要是纖維素、有機酸等難降解大分子物質，微藻對其同化降解能力較低、速度較慢[14]。 柵藻SNN1 對不同pH 生活污水中氮的去除效果如圖1(b)和(c)所示。 由圖1(b)可知，除pH ＝6.0 的實驗組外，在處理末期，生活污水中的-N 基本可以去除。 由圖1(c)可知，除pH＝6.0 的實驗組外，在實驗末期，其他實驗組的TN 都能降到較低的水平。 當pH ＝9.0時，TN 由97.25 mg/L降至2.92 mg/L，去除率最高可達97.00%；當pH＝6.0 時，TN 降至31.62 mg/L，去除率最低僅為67.48%。 這與許海等[15]得出的斜生柵藻適宜在高pH 條件下生長的結論相符。 柵藻SNN1 對不同pH生活污水中P 的去除效果如圖1(d)所示。 經過12 d的處理，在不同pH 的生活污水中柵藻SNN1 對TP去除率基本都能＞95%。 柵藻SNN1 在較短的時間內能將TP 降到比較低的水平。

圖1 不同初始pH 對柵藻SNN1 處理生活污水效果影響圖

有研究[15]表明，pH 主要通過影響藻類生長來影響脫氮除磷作用，表現在:(1) 藻細胞只能在適當的酸堿度范圍內正常發育增殖，酸性或堿性過強均會對藻類細胞產生破壞；(2) pH 能干擾碳酸鹽平衡體系與各種形態的無機碳分配關系，進而干擾藻細胞發育。 綜上所述，柵藻SNN1 在初始pH ＝9.0 的情況下，對生活污水中COD、-N、TN 和TP 的去除率均達到最高。

2.1.2 初始pH 對柵藻SNN1 生物質積累的影響

pH 不僅可通過引起細胞膜電荷變化和影響營養物離子化程度來影響微生物對營養物的吸收，而且還影響細胞中各種酶的活性。 初始pH 對柵藻SNN1 生物質影響如圖2 所示。 低pH 會對柵藻SNN1 的生長產生抑制作用，按柵藻SNN1 的生物量由高到低，各pH 實驗組順序為9.0 ＞空白對照組＞8.0＞7.0＞6.0。 空白對照組的生物量高于pH ＝8.0組，可能是實驗誤差所致。 在pH ＝9.0 時，最大生物量達到1.08 g/L。 隨著pH 降低，微藻生物量逐漸下降，當pH＝6.0 時，生物量僅為0.31 g/L，相對于pH ＝9.0 時下降了71.3%。

圖2 柵藻SNN1 在不同初始pH 生活污水中的生物量情況圖

不同初始pH 的生活污水中，柵藻SNN1 的油脂生產情況如圖3 所示。 初始pH 為7.0 ～9.0，柵藻SNN1 的油脂比例和油脂產量隨pH 升高而增加，初始pH＝9.0 時，油脂比例和油脂產量的最大值分別為24.72%和267.00 mg/L。 隨著pH 的降低，油脂產量明顯下降，但在生活污水初始pH ＝6.0 條件下，柵藻SNN1 的油脂最高為33.76%。 這與王秀良等[16]報道的微綠球藻在pH ＝6.8 的時候總脂比例與脂肪酸比例最高基本相符。 由此可見，偏酸性條件更有利于柵藻SNN1 油脂的積累，但是由于其生物量不足，油脂產量大大降低，均低于其他實驗組。 因此，確定柵藻SNN1 生產油脂的最適初始pH 為9.0。

圖3 柵藻SNN1 在不同初始pH 生活污水中油脂比例及油脂產量圖

2.2 不同初始接種量對柵藻SNN1 處理污水及生物質積累的影響

2.2.1 不同初始接種量對柵藻SNN1 處理生活污水的影響

調節生活污水初始pH ＝9.0，起始OD680值為0.1、0.2、0.4 和0.6。 不同初始接種量下柵藻SNN1對生活污水中污染物去除情況如圖4 所示。 圖4(a)為不同初始接種量下柵藻SNN1 對污水中COD的去除情況。在加大接種量的情況下，能夠增加COD 的去除效率。 在培養初期的4 d 內，各個實驗組污水中的COD 下降速度較快，之后COD 基本趨于平穩。 在實驗末期，接種量OD680分別為0.4、0.6的實驗組較其他兩組去除效果好，對COD 的去除率基本相同，分別為47.70%和47.98%，高于其他兩組。 不同初始接種量下柵藻SNN1 對污水中-N 的去除情況如圖4(b)所示。 4 個不同接種量下，-N 隨著培養時間的增加逐漸下降，在培養6 d 后，最終4 個實驗組中-N 穩定于較低水平。 到實驗后期水中的-N 基本可以去除，去除率均＞95%。 圖4(c)為不同初始接種量下柵藻SNN1 對生活污水中TN 處理情況。 隨著接種量的提高，柵藻SNN1 對生活污水中TN 的去除率隨之上升，在初始OD680為0.6的條件下，去除效果最為顯著，從最初的96.48 mg/L下降到2.62 mg/L，去除率為97.29%。 不同初始接種量下柵藻SNN1 去除生活污水中TP 的情況如圖4(d)所示。 與TN 有所不同，生活污水中P 較低，柵藻SNN1 在處理12 d 后，在不同初始接種量下，TP 基本上都有＞95%的去除率。 綜上所述，綜合考慮接種量OD680＝0.6 是柵藻SNN1 處理生活污水的最佳接種量。

圖4 不同初始接種量下柵藻SNN1 對生活污水中污染物的去除情況圖

2.2.2 不同初始接種量對柵藻SNN1 生物質積累的影響

微藻的初始密度可以改變微藻生長微環境(照度、營養、空間、脅迫及分泌物積累等[17-18])。 接種密度也是影響微藻生產性培養時增殖速率和采收生物量的重要因素[19-20]。 對比初始接種量OD680為0.1、0.2、0.4、0.6 的生物量變化(如圖5 所示)，可以看出接種初期生長較快，在生長后期逐步進入平穩階段。 在初始OD680為0.6 的條件下，柵藻SNN1 的生物質產量培養12 d 后達到最高的1.34 g/L，為各個實驗組最高。 初始OD680為0.2 和0.4 的實驗組略有優勢，生物量為1.08、1.13 g/L。 而初始接種量為0.1 時，廢水生長情況相對較差，最終生物量為0.98 g/L。 造成這樣的原因是初始OD680為0.6 組的藻液質量濃度高，對生活污水的適應性較好，對營養物質的吸收速率高，將污水中的大部分營養物質加以利用，因而在前期生長較快。 在實驗后期，初始OD680為0.6 組的生物量略有下降，原因可能是:藻液質量濃度高降低了透光率，在實驗后期影響了柵藻SNN1 的生長；實驗后期生活污水中營養物質減少也限制其生長。

圖5 不同初始接種量下柵藻SNN1 的生物量情況圖

不同初始接種量下，柵藻SNN1 的油脂生產情況如圖6 所示。 柵藻SNN1 的油脂比例和油脂產量隨著初始接種量的提高逐步下降。初始接種量OD680為0.6 時，藻株油脂比例和油脂產量分別為18.94%、250.33 mg/L。 油脂比例為4 個實驗組最低，而油脂產量略高于初始OD680為0.4 的實驗組(245.00 mg/L)。 初始接種密度過大，導致微藻生長后期營養供給不足，進入衰亡期，微藻細胞進行內源物質的消耗，從而導致較低的油脂產量和油脂比例。而初始接種量OD680＝0.1 時，藻株油脂比例和油脂產量分別為29.54%、291.33 mg/L，均高于其他實驗組。 由此可知，在此初始接種量下，藻種可獲得相當的油脂產量和油脂比例。 因此選擇初始接種量OD680＝0.1 為柵藻SNN1 培養產油的最佳值。

圖6 不同初始接種量下柵藻SNN1 油脂比例及油脂產量圖

綜上所述，柵藻SNN1 處理生活污水和生物量積累的最佳培養條件為生活污水初始pH ＝9.0、初始接種量OD680＝0.6。 生產油脂的最佳培養條件為初始pH＝9.0、初始接種量OD680＝0.1。 培養條件優化前后柵藻SNN1 對生活污水污染物質的去除率、生物量積累及產油情況見表1。 經過優化培養后，柵藻SNN1 對生活污水污染物去除率都有一定的提升，其中COD 最為明顯，去除率提高了17.30%，獲得的生物量、油脂比例和油脂產量分別是優化前的1.28、1.29 和1.21 倍。 優化后對生活污水水質凈化效果和微藻生物質積累都有顯著提高。

表1 柵藻SNN1 培養條件優化前后生活污水處理及生物質積累情況表

3 討論

不同藻株生長的最適pH 不同，當偏離最適pH時，藻株生長和體內的代謝活動會受到抑制。 pH 的變化會影響微藻細胞在光合作用中酶的活性，影響微藻生物量的積累[21]。 KHALIL 等[22]以NaOH/鹽酸溶液控制培養液的pH，研究了不同pH(4、6、7.5、8、9、10、11)對橢圓形小球藻生長的影響，表明小球藻可以在較寬的pH 范圍(4 ～10)內生長，在堿性條件下(pH 為9.0 ～10.0)獲得了最大生物質產量，在pH 為10 ～11 時生物質產量有所下降。 MARCEKCHORVATOVA 等[23]研究表明，大多數藻類在pH為7～9 的范圍生長繁殖，最佳pH 為8.2 ～8.7，中性或pH 較低的水會降低藻類的生長活性。 文章研究表明，隨著生活污水初始pH 的升高，柵藻SNN1 對生活污水中營養物質處理效果與自身生物量的積累也逐漸增強。 pH＝9.0 的條件對生活污水中營養物質的去除效果最好，自身生物量也達到最大值。 由此可推知，柵藻SNN1 喜好偏堿性環境，且初始pH為9.0 的條件下更適宜生長，是微藻處理生活污水的最適pH。

微藻的初始接種量會影響其在不同時間內的生物量以及對營養物質的去除:初始接種量太低，則初始生長速率較慢，對污染物的去除效率降低；接種量過高，微藻雖可較快進入指數生長期，但過多的藻會讓藻細胞間相互遮光，光合作用效率降低，影響微藻生長和葉綠素合成[24]，大規模培養時會造成藻株成本過高，也不利營養物質的去除。 蕭銘明[25]研究發現當接種量為50%時，在酒精廢水中培養的鈍頂螺旋藻干重平均值最高；而接種量為30%時葉綠素a平均值最高。 項藎儀[26]的研究表明當用小球藻處理市政污水時，接種OD680為1.2 時小球藻脫氮除磷的效果較好。 在文章研究中，當初始接種量為0.6時，柵藻SNN1 對生活污水中COD、TN 去除效果較好，生物量的積累也達到最高。 因此，接種量為0.6時，柵藻SNN1 即可有效去除生活污水中的營養物質，又能達到較高生物量的積累。

經過優化實驗條件，柵藻SNN1 生產油脂的最佳培養條件為:生活污水初始pH ＝9.0、微藻初始接種量OD680＝9.0。 在此條件下培養12 d，藻株油脂比例和油脂產量分別為29.54%、291.33 mg/L。 油脂比例、油脂產率分別是優化前的1.29 和1.21 倍，說明柵藻SNN1 具有一定的產油潛力，在后續實驗中可進一步探究。

4 結論

經過上述研究，得到以下結論:

(1) 以實驗室前期分離的柵藻Desmodesmussp.SNN1 為目標藻株，優化其在生活污水中的培養條件，處理生活污水最佳條件為污水初始pH ＝9.0、微藻初始接種量OD680＝0.6。 在此條件下培養12 d后，污水的COD、-N、TN 和TP 的去除率分別為47.98%、99.93%、97.29%和97.13%，最終生物量可達1.34 g/L。

(2) 微藻生產油脂的最佳培養條件為初始pH ＝9.0，初始接種量OD680＝0.1。 在優化條件下培養12 d后， 油脂比例和油脂產量分別為29. 54%、291.33 mg/L。 去除效果與生物質產量較未優化時有了進一步的提高。