針灸預處理調控TLR4/MyD88/NF-κB信號通路抗大鼠胃黏膜損傷機制研究

蘭永利,周知然,韋 芳,霍新慧

(1.新疆醫科大學中醫學院,新疆 烏魯木齊830001;2.新疆維吾爾自治區中醫醫院,新疆 烏魯木齊830001)

隨著人們生活方式的變化,酒精的長期飲用逐漸成為刺激胃腸組織器官正常生理結構的主要因素之一,其中胃黏膜的損傷就是酒精刺激直接引起的組織損傷[1]。胃黏膜損傷主要為黏膜組織的充血、水腫、糜爛、潰瘍,病變較重時侵及黏膜,發生上消化道出血[2]。有研究顯示,炎癥反應在胃黏膜組織病變中擔任著關鍵的角色[3],炎癥反應是機體應對有害刺激而促進修復的自我防御措施,然而當炎性因子分泌過多時,會使原本的穩態環境被打破,導致疾病的進一步惡化發展。

針灸作為中醫學的重要組成部分,在經絡辨證的指導下,在疾病防治方面具有實用價值[4-5]。特別是灸法,以其特有的綠色療法和簡便性的特點,在臨床認可度比較高。本課題組前期研究表明[6],針灸預處理能夠加強胃黏膜微循環屏障,上調與屏障相關的保護因子,下調損傷因子,達到對胃黏膜組織的保護作用。

Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)/髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)/核因子-κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號通路主要是與炎性因子,如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-β(IL-β)等的釋放有關,在炎癥反應的發生發展中起著關鍵性的作用[7]。此研究是基于對大鼠胃黏膜中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達水平的觀察,進一步探究針灸對胃黏膜“治未病”的作用機制,為應用于臨床預防提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級,雌雄各半SD大鼠52只,體重(180±20)g,新疆醫科大學動物實驗中心購得,動物合格證號:SYXK(新)2018-0003,由新疆醫科大學動物實驗中心喂養。大鼠自由攝食、攝水,飼養室溫度:20～25 ℃,相對濕度:50%～54%,自然晝夜交替。在實驗開始前適應性飼養7 d后進行實驗,實驗全程動物處理遵照本校動物實驗中心倫理委員會要求進行。

1.2 藥物與試劑 無水乙醇(天津市凱通化學試劑有限公司),阿司匹林腸溶片(拜耳醫藥保健有限公司,國藥準字J20130078),大鼠TNF-α ELISA試劑盒(上海優選生物科技有限公司,批號:YX-E21174);大鼠IL-1β ELISA試劑盒(上海優選生物科技有限公司,批號:YX-E20958)。

1.3 實驗儀器 實驗用一次性針灸針(華佗牌,規格0.25 mm×13 mm),艾灸條(南陽漢醫艾絨有限責任公司,規格4 mm×120 mm),固定支架(蘄春上工記艾灸器具開發有限公司),酶標分析儀(型號:Infinite F50,上海優選生物科技有限公司),高速冷凍離心機(德國,型號:Eppendorf 5415C),分光光度計(日本,型號:SHIMAZDU UV-2540),蛋白印跡儀(臺灣威泰克有限公司,型號: Yrdimes SW07D0567),臺式恒溫振蕩器(中國上海精宏實驗設備有限公司,型號:THZ-312),凝膠成像分析系統(臺灣威泰克有限公司,型號:KETAM多用凝膠成像系統)。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組與干預方式:采用數字編號法對大鼠進行標號,而后按照隨機數字表法將其分為正常組、模型組、預灸組、針預組,每組13只。在適應性飼養7 d之后,每日上午10:00開始進行針灸預處理的干預操作。

腧穴的取穴依據《實驗針灸學》常用動物穴位定位法進行確定[8]。中脘穴位于臍上約 20 mm;足三里穴位于膝關節后外側,在腓骨小頭下約3 mm處。

正常組:艾灸支架固定,20 min/次,不做處理,1次/d,連續7 d;模型組:艾灸支架固定,20 min/次,不做處理,1次/d,連續7 d;預灸組:艾灸支架固定,溫和灸懸灸中脘、足三里(雙),20 min/次,1次/d,持續7 d;針預組:艾灸支架固定,一次性針灸毫針針刺中脘、足三里(雙),平補平瀉,20 min/次,1次/d,持續7 d;每次處理結束之后,解除大鼠支架固定,回飼養室進行正常喂養,連續預處理7 d。

1.4.2 造模:在預處理7 d結束之后,第8天禁食不禁水,第9天開始對模型組、預灸組、針預組進行胃黏膜損傷模型的制備。應用動物實驗室常用灌胃手法,采用無水乙醇與阿司匹林混懸液法建立模型,阿司匹林腸溶片與0.9%氯化鈉溶液(2000 mg∶100 ml)配制成阿司匹林混懸液,先用無水乙醇0.6 ml/100 g進行灌胃,1 h后再予以阿司匹林混懸液200 mg/kg進行灌胃造模,造模4 d。

1.5 觀察指標

1.5.1 血清及胃黏膜組織采集:第1天造模結束后,當天22:00禁食禁水,第13天上午10:00開始取材。采用10%水合氯醛麻醉,起效后,腹主動脈取血,使用離心機離心后取上層血清,解剖將全胃取出,沿胃大彎剪開,用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈,充分暴露胃黏膜組織,拍照觀察胃黏膜損傷情況,評定胃黏膜損傷指數(UI),后分成兩部分,一部分在4%多聚甲醛中固定,用于指標檢測,另一部分儲存于-80 ℃液氮中。

1.5.2 一般情況及體重:對大鼠攝水攝食、毛發、大便、活動度,精神、體重等一般情況進行觀察[9],體重每4 d測量1次。

1.5.3 評定胃黏膜損傷指數(UI):采用GUTH[10]法進行計算。將胃黏膜組織應用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈,然后平鋪于濾紙上,在10倍放大鏡下,用肉眼觀察,卡尺測量評估損傷程度:1分為損傷(包括糜爛點)<1 mm;損傷介于1～2 mm為2分;損傷介于2～3 mm為3分;損傷介于3～4 mm為4分;損傷>4 mm為5分;損傷寬度>2 mm的時候計分加倍。UI評分為胃黏膜各處損傷計分后值的累加。

1.5.4 ELISA法檢測TNF-α、IL-1β濃度:腹主動脈取血,3000 r/min離心20 min,收集上清液,并在-80 ℃冰箱中儲存待測。嚴格遵照ELISA試劑盒方法說明進行操作,計算TNF-α、IL-1β的濃度。

1.5.5 免疫組織化學法檢測胃黏膜組織TLR4、MyD88、NF-κB p65表達:嚴格按照試劑盒方法進行操作,將常規石蠟包埋和組織切片經抗原修復后,用正常羊血清液封閉20 min,將配制好的TLR4工作液(1∶50稀釋)以及MyD88、NF-κB一抗工作液(1∶100稀釋)滴加在組織上,4 ℃過夜,PBS洗滌后滴加生物素化第二抗體、辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP),DAB顯色、復染、封片后,400倍的顯微照相,并進行圖像分析。

1.5.6 Western blot檢測胃黏膜組織TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表達:取100 mg胃黏膜固體組織,在培養皿中剪碎成3 mm×3 mm左右的小塊,使用0.5～1 ml冷RIPA裂解液進行勻漿,充分裂解后,離心20 min(4 ℃、10000 r/min)取上清液,蛋白濃度采用BCA法測定。進行電泳、轉膜、封閉,加入對應的TLR4、MyD88和NF-κB(1∶1000)一抗,4 ℃孵育過夜,用5%脫脂奶粉封閉液稀釋二抗(1∶8000),室溫搖床振蕩反應1～2 h。洗膜10 min 3次后,ECL發光法顯色。使用Gel-Pro Analyzer 4軟件對結果進行灰度分析。

1.6 統計學方法 采用SPSS 26.0統計學軟件,使用Graph Pad Prism 8軟件制作圖。數據均進行正態性和方差齊性檢驗,組間比較采用單因素方差分析,方差齊用LSD法分析,方差不齊用 Dunnett’sT3法;P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況比較 造模前及針灸預處理期間,四組大鼠攝水攝食及二便情況正常,毛發有光澤、靈活好動,精神良好,體重上升。造模期間,模型組大鼠攝水攝食量較前明顯減少,大便夾有血絲,毛發暗淡,精神萎靡,體重下降;預灸組和針預組大鼠較模型組情況都較輕,與針預組相比,預灸組大鼠體重有所上升。見表1。

表1 各組大鼠造模前、預處理、造模后體重比較(g)

2.2 各組大鼠UI評分比較 見表2(圖1)。正常組胃黏膜組織表面光滑,與正常組相比,模型組胃黏膜組織表面出現明顯出血灶,UI指數上升(P<0.05),提示模型制備成功;與模型組相比,預灸組和針預組胃黏膜組織表面只有少量出血灶,UI指數下降(P<0.05),提示針灸預處理對預防胃黏膜損傷有效;與針預組相比,預灸組胃黏膜組織表面出血灶點更少,UI指數下降(P<0.05),提示艾灸效果強于針刺。

圖1 胃黏膜組織在肉眼下的形態表現

表2 各組大鼠UI評分比較(分)

2.3 各組大鼠胃黏膜TNF-α、IL-1β濃度比較 見表3。與正常組相比,模型組大鼠TNF-α、IL-1β濃度上升(P<0.05);與模型組相比,預灸組和針預組大鼠TNF-α、IL-1β濃度均明顯下降(P<0.05),與針預組相比,預灸組大鼠TNF-α、IL-1β濃度均明顯下降(P<0.05)。

表3 各組大鼠胃黏膜TNF-α、IL-1β濃度比較(pg/ml)

2.4 各組大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達免疫組化結果比較 見表4(圖2～4)。與正常組比較,模型組大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65表達均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,預灸組和針預組TLR4、MyD88、NF-κB p65表達均顯著降低(P<0.05);與針預組比較,預灸組TLR4、MyD88、NF-κB p65表達均降低(P<0.05)。

圖2 灸預處理對胃黏膜損傷大鼠胃黏膜TLR4蛋白表達(免疫組化染色,×200)

表4 各組大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達免疫組化結果比較

2.5 各組大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達Western blot檢測結果比較 見表5(圖5)。與正常組比較,模型組大鼠TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達顯著升高(P<0.05);與模型組比較,預灸組和針預組大鼠TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達顯著降低(P<0.05);與針預組比較,預灸組大鼠TLR4、 MyD88蛋白表達降低(P<0.05),NF-κB p65蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。

圖5 各組大鼠胃黏膜組織TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白免疫印跡圖

表5 各組大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達Western blot檢測結果比較

3 討 論

胃黏膜組織作為胃的第一道保護屏障,確保胃黏膜的完整性可以增強胃黏膜組織的自我修復和防御能力,而一旦胃黏膜受到損傷,就會導致胃黏膜病變相關疾病的發生發展[11],因此對胃黏膜損傷的預防成為人們所關注的熱點。《脾胃論》中指出脾胃衰而百病生,《內經》中指出正氣存內、邪不可干,說明機體正氣不足,會引起邪氣入侵,導致疾病[12]。根據患者胃黏膜損傷后的臨床表現,其在中醫學中屬于“胃脘痛”[13],病因主要為外邪侵襲、脾胃虛弱、生活不規律等[14]。根據中醫理論,脾胃之病重在養護,脾胃為“后天之本、氣血生化之源”,脾氣衰則氣血生化乏源,無法將水谷轉化為人體所需的精微物質營養全身,導致人體陰陽失衡,容易受到病邪侵襲[15]。針灸通過“未病先防”理論調整機體生理功能,激發自我修復的能力,維持人體陰陽平衡,預防疾病發生發展[16]。孫思邈首次在《備急千金要方》中提出了灸法“治未病”理論,其中記載了灸法對于疾病的防治和保健都具有重要的作用,奠定了灸法“治未病”的理論基礎[17]。艾葉作為灸法的常用中藥,其味辛、苦,性溫,其功用為溫通散寒。脾胃喜溫,艾灸可通過溫熱刺激固護脾胃之氣,來達到調整人體氣血陰陽的目的。對于胃黏膜損傷的治療,有研究表明[18],艾灸胃經穴可增加胃黏膜血流量,減輕胃黏膜損傷病理狀態。

應用六腑的下合穴與本經募穴配合,治療六腑病證的配穴方法稱為“合募配穴”[19]。“合治內腑”,下合穴常常治療六腑相關病癥,募穴偏于治療腑病和陽經病癥,合募配穴通過調暢氣機來達到治療腑病的目的[20]。足陽明胃經的下合穴為足三里,臨床作為防病保健,扶正祛邪的要穴,中脘為胃之募穴,二者合用可調理脾胃、扶助正氣。有實驗證明[21],針刺、艾灸足三里和中脘穴可改善機體微循環,調節機體免疫功能,增強胃黏膜的自我修復和防御能力,達到理想的治療效果。

本實驗基于無水乙醇和阿司匹林混懸液制備胃黏膜損傷模型。無水乙醇可直接對胃黏膜造成損傷,并可降低胃黏膜自我修復因子的保護作用,是一種高刺激性損傷胃黏膜的攻擊因子[22]。阿司匹林混懸液會使環氧合酶的活性降低,從而使胃黏膜黏液、血流量降低,防御力下降[23],導致胃黏膜損傷。采用兩種藥物進行大鼠胃黏膜損傷模型的制備,可加大對胃黏膜組織的刺激,縮短模型制備時間,增加成功率。HE染色觀察大鼠胃黏膜組織病理學變化,可見大鼠胃黏膜組織出現出血灶,并且有炎性細胞浸潤,提示模型制備成功。

TLR4/MyD88/NF-κB信號通路是調控炎癥反應的重要途徑之一,在免疫及炎癥機制中發揮著重要作用[24]。TLRs是一類機體內天然的免疫受體,MyD88作為TLR4的下行信號因子[25],在炎性因子(TNF-α、IL-6)進入細胞內時,TLR4介導MyD88下行表達,進而磷酸化NF-κB因子,激活炎性因子的釋放,參與炎癥反應[26]。在本實驗研究中,與正常組相比,模型組大鼠胃黏膜組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65表達均顯著升高;與模型組比較,預灸組和針預組大鼠TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達顯著降低;與針預組比較,預灸組大鼠TLR4、 MyD88蛋白表達降低,NF-κB p65蛋白表達差異無統計學意義。結果表明,針灸預處理可通過影響TLR4/MyD88/NF-κB信號通路蛋白表達水平,減少炎性因子的釋放,抑制通路的級聯反應,從而預防胃黏膜的損傷程度。

綜上所述,針灸預處理可以降低TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達水平,減少炎性因子的釋放,增強胃黏膜的自我修復和防御能力,從而對胃黏膜起到保護作用。與針預組比較,預灸組大鼠TLR4、 MyD88蛋白表達降低,NF-κB p65蛋白表達差異無統計學意義,提示針刺和艾灸兩者對胃黏膜保護的效應相同,可能調控的機制存在著不同,需要進行進一步的研究探討,為臨床提供實驗依據。