MLO-Y4來源外泌體對破骨細胞調控機制的研究

趙麗洲 勾蓉 王晨 涂小林*

1. 重慶醫科大學生命科學研究院骨發育與再生實驗室,重慶 400016

2. 重慶大學附屬腫瘤醫院體檢中心,重慶 400030

3. 陸軍軍醫大學西南醫院,重慶 400038

破骨細胞來源于骨髓中的造血干細胞,是由單核細胞/巨噬細胞通過融合形成具有骨吸收功能的多核巨細胞[1],其生理分化需要TNF超家族成員NF-κB配體受體激活劑(receptor activator of nucler factor-κB ligand,RANKL)的介導[2], RANKL與破骨前體細胞膜上的κB受體活化因子(receptor activator of nucler factor-κB,RANK)結合,通過銜接NF-κB通路導致破骨細胞生成關鍵轉錄因子NFATc1的誘導和激活[3-5],調控破骨細胞生成和分化。RANKL主要由骨細胞和成骨細胞分泌[6-7],與促進破骨前體細胞增殖的巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)聯合使用可以在體外誘導具有骨吸收能力的破骨細胞的形成。

骨細胞是破骨分化必需因子RANKL的主要來源細胞。研究表明,骨細胞中RANKL基因敲除導致小鼠松質骨量大增,且同時能增加成骨功能不全小鼠的松質骨[8]。體外實驗也驗證,在三維羥基磷灰石/磷酸三鈣支架中,增加靜水壓導致骨細胞樣細胞系MLO-Y4中RANKL高表達,并促進破骨前體細胞系RAW264.7成破骨細胞[9]。前期實驗發現骨細胞Wnt信號激活小鼠破骨細胞增加,骨吸收能力增強[10],骨細胞的脫細胞基質修飾3D打印PCL支架,促進成骨分化、礦化與破骨細胞生成[11]。由此可見,在生理狀態下,骨細胞具有重要的破骨細胞調控功能。

骨細胞被包埋在堅硬的礦化骨基質中,較難與其他細胞通過直接接觸傳遞信號,所以骨細胞衍生因子的產生與傳遞方式是其調控破骨細胞的關鍵。外泌體是一種圓形膜結合的囊泡,由細胞分泌到細胞外基質中,具有與衍生細胞相同的膜成分和一些細胞質內容物如脂類、蛋白質、核酸組成的DNA和RNA等,通過囊泡膜和細胞膜的融合將分泌因子從相關細胞轉移到循環途徑中的其他細胞[12-15]。

研究顯示,骨細胞外泌體通過miR-181b-5P激活蛋白激酶B(Akt)促進人牙周膜干細胞的成骨分化[16]。肌肉生長抑制素處理的骨細胞其外泌體通過miR-218阻斷Runx2和Wnt途徑以抑制成骨分化[17]。成骨細胞外泌體通過RANKL-RANK信號激活Nfatc1核位移促進破骨細胞分化[18]。但骨細胞來源的外泌體對破骨細胞的作用研究甚少。本研究擬通過提取骨細胞樣細胞MLO-Y4來源外泌體,探討其對破骨細胞分化的影響及分子機制。

1 材料和方法

1.1 動物實驗

4至6周齡C57BL/6J野生型小鼠(WT)獲自重慶醫科大學動物設施(中國)。所有動物實驗均經重慶醫科大學動物護理與使用委員會批準。

1.2 試劑

胎牛血清(FBS)購自加拿大Wisent公司。小鼠RANKL和M-CSF重組蛋白購自美國PeproTech公司。CD63和Alix抗體購自中國萬類生物科技有限公司。α-MEM培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司;青、鏈霉素及胰酶購自中國碧云天公司;TRIzol、反轉錄和實時熒光定量PCR試劑盒購自中國艾科瑞公司;PCR引物來自生上海工生物工程股份有限公司。

1.3 細胞培養

1.3.1骨細胞系MLO-Y4:骨細胞系MLO-Y4細胞由美國 Lynda Bonewald 教授贈予,在含有10 %FBS和1 %青霉素/鏈霉素的α-MEM培養基中培養,0.25 %的胰酶消化傳代。

1.3.2骨髓單核巨噬細胞:從C57BL/6J野生小鼠股骨和脛骨提取原代骨髓細胞,在含有10 %FBS和1 %青霉素/鏈霉素的α-MEM培養基中培養3 d,將非粘附細胞轉移到新的培養皿中,加入30 ng/mL M-CSF重組蛋白繼續培養3 d,通過胰蛋白酶消化收集粘附細胞即骨髓巨噬細胞(bone marrow macrophages,BMM),作為破骨前體細胞使用[19]。

1.4 外泌體的分離和鑒定

通過文獻報道的方法提取細胞外泌體[20-21]。使用前將FBS 100 000 g超速離心18 h以去除牛外泌體[22]。收集MLO-Y4的48 h條件培養在4 ℃下依次300 g離心10 min, 2 000 g離心10 min,10 000 g離心30 min去除細胞和細胞碎片,然后通過低溫超速離心機(Beckman Coulter,美國)100 000 g離心70 min以收集外泌體。無菌PBS重懸外泌體沉淀,用于細胞培養和動物實驗。外泌體的蛋白含量通過BCA蛋白檢測試劑盒(Beyotime,中國上海)檢測。透射電子顯微鏡鑒定純化的外泌體大小及形態,Western blot鑒定外泌體標志蛋白表達。

1.5 細胞共培養和TRAP染色

BMM以4×104個/孔的密度混勻接種于48孔板,加入M-CSF(30 ng/mL)+RANKL(30 ng/mL)或M-CSF(30 ng/mL)+RANKL(30 ng/mL)+MLO-Y4-Exo(15 μg/mL)于共培養體系中。培養液每3 d更換1次。5～9 d后,顯微鏡普通光源鏡檢可見大的多核破骨細胞在孔板中形成,即可收獲細胞。細胞用4 %甲醛溶液固定10 min,然后蒸餾水洗2次并晾干,根據TRAP染色試劑盒說明書(Sigma-Aldrich,美國)對細胞進行染色,顯微鏡鏡檢并計數每孔TRAP陽性(紅色)細胞數量。

1.6 RNA 提取及qPCR實驗

使用TRIzol試劑提取細胞RNA,測定濃度后按照反轉錄試劑盒(艾科瑞,中國)說明書進行反轉錄,獲得的 cDNA作為 qRT-PCR 反應的模板[23]。相對表達量采用2-ΔCt分析, 以CHoB的表達水平作為標準。所用引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.7 細胞免疫熒光(IF)檢測

單核巨噬細胞細胞用4 %多聚甲醛固定10 min, 然后用0.25 %Triton X-100透化30 min,5 %牛血清白蛋白封閉30 min后與RANKL一抗孵育過夜,然后用Cy3標記的羊抗兔IgG抗體(cell signaling technology,美國)室溫孵育1 h。隨后,用DAPI(碧云天,中國)標記細胞核,熒光顯微鏡觀察RANKL表達量。

1.8 小干擾RNA(siRNA)轉染實驗

RANKL小干擾RNA質粒(序列:GGATGAAACAAGCCTTTCA)構建于RIBOBIO公司,溶解于無菌ddH2O至終濃度20 μmol/L,與Zeta Life轉染試劑以體積1∶1比例混勻靜止10～15 min后加入MLO-Y4細胞培養皿,轉染24 h 后對細胞正常換液,48 h后Cy3-siRNA轉染細胞通過熒光顯微鏡檢測轉染效率,RANKL-siRNA轉染細胞進行RNA檢測或收集外泌體。

1.9 免疫組織化學檢測(IHC)

4～6周齡C57BL/6J野生型小鼠顱骨皮下注射PBS和MLO-Y4-Exo連續5 d,在第6 天收獲小鼠顱骨甲醇固定后脫鈣[24-25]。脫水后將顱骨垂直于矢狀縫包埋在石蠟中,并切成5 μm厚的切片。切片脫蠟后分別用于免疫組織化學和TRAP染色,染色方法如報道所述[11]。切片通過OsteoMeasure TM軟件對TRAP陽性細胞進行分析計數。

1.10 Western blot

根據上述方法提取MLO-Y4外泌體,加入適量的 RIPA 裂解液,然后在冰上進行超聲破碎。按照BCA試劑盒說明書測量蛋白濃度,加入上樣緩沖液,金屬浴100 ℃,8 min。使用試劑盒配膠,每孔上樣 30 μg。上層膠采用 70 V 恒壓,樣品進入下層膠后采用 120 V恒壓電泳,210 mA恒流轉膜1 h 后,使用5 %脫脂奶粉于室溫搖床封閉 2 h。然后在4 ℃孵育一抗過夜,第 2 天使用 TBST洗膜,室溫下孵育二抗2 h,TBST 洗膜后顯影。

1.11 ELISA實驗

將上述方法獲得的MLO-Y4外泌體,使用RIPA裂解液重懸后利用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測濃度。提前將ELISA試劑盒在室溫平衡30 min,根據蛋白濃度,每孔加相同蛋白量,然后用緩沖液補充至相同體積,封板膜蓋住反應板,37 ℃水浴鍋溫育60 min,然后用洗滌液洗滌5次,然后將底物A和B以1∶1混合后加入反應孔中,37 ℃水浴鍋溫育15 min,加入終止液,在酶標儀450 nm波長上測量吸光度,采用四參數Logistic曲線擬合,創建標準曲線方程。

1.12 統計學處理

2 結果

2.1 MLO-Y4來源的外泌體的分離和鑒定

外泌體的鑒定依賴于報道的標準[26],外泌物的大小范圍為30至200 nm,在透射電子顯微鏡下呈杯狀形態,具有特定的標記蛋白如CD63和Alix[27-29]。在我們的研究中,從MLO-Y4細胞培養液中分離的外泌體在離心管中呈白色沉積物(圖1A)。在透射電子顯微鏡觀察下呈圓形,直徑約100～150 nm,具有完整的膜脂雙層,并顯示杯狀形態(圖1B)。Western blot實驗顯示MLO-Y4-Exo表達CD63和Alix蛋白(圖1C)。

注:A:外泌體離心沉淀圖,B:透射電子顯微鏡觀察外泌體;C:Western blot檢測外泌體標志蛋白表達。

2.2 MLO-Y4來源的外泌體促進破骨細胞分化

MLO-Y4-Exo與BMM共培養5～9 d后進行TRAP染色(圖2A),MLO-Y4-Exo組TRAP陽性的單核細胞和大于三個核的破骨細胞均增多(圖2B),qPCR顯示MLO-Y4-Exo組細胞的破骨細胞標志基因表達增加(圖2C),說明MLO-Y4-Exo促進BMM成破骨細胞分化。

注:A:細胞TRAP染色;B:TRAP陽性細胞(紅色)計數;C:qPCR檢測破骨細胞標志基因mRNA表達量。n=3, 與 Control比較,*P<0.05。

2.3 MLO-Y4來源的外泌體在體內促進破骨細胞的形成

在小鼠頂骨皮下連續注射5 d外泌體后,收獲小鼠顱骨用于TRAP染色(圖3A),并通過OsteoMetrics對破骨細胞進行骨組織形態學定量分析。在注射MLO-Y4-Exo的小鼠的顱骨中發現了豐富的破骨細胞,單位組織面積破骨細胞數量(N.Oc/T.Ar)、單位骨周長破骨細胞數量(N.Oc/B.Pm)和單位骨表面的破骨細胞表面(Oc.S/BS)均增加(圖3B)。

注:A:組織TRAP染色;B:破骨細胞計數。n=5, 與Control比較,*P<0.05。

2.4 MLO-Y4來源的外泌體傳遞RANKL

原代小鼠BMM細胞的RANKL免疫熒光染色結果顯示,PBS處理組BMM中紅色熒光較少,RANKL表達量極低,MLO-Y4-Exo處理組BMM中RANKL含量增加(圖4A)。小鼠顱骨切片免疫組化檢測顯示,與注射PBS的組相比,注射MLO-Y4-Exo的小鼠顱骨RANKL表達更高(圖4B),這解釋了MLO-Y4-Exo治療組顱骨破骨細胞增多的原因。

注:A:免疫熒光染色檢測BMM細胞中RANKL表達;B:骨組織切片免疫組化染色檢測RANKL表達。

2.5 MLO-Y4來源的外泌體通過RANKL促進破骨細胞分化

siRNA-FAM質粒處理MLO-Y4細胞48 h后,在熒光顯微鏡下觀察轉染效率(圖5A)。siRNA-RANKL轉染MLO-Y4后,qPCR檢測顯示細胞RANKL mRNA表達降低(圖5B)。獲取MLO-Y4細胞外泌體,采用RIPA裂解液裂解外泌體囊泡膜,然后采用ELISA測量RANKL含量,發現siRNA-RNAKL敲低MLO-Y4中RANKL基因后,外泌體囊泡中RANKL蛋白含量降低(圖5C)。細胞外泌體(siRANKL-MLO-Y4-Exo)用于BMM培養,TRAP染色顯示siRANKL-MLO-Y4-Exo處理組較MLO-Y4-Exo組和siNC-MLO-Y4-Exo組的TRAP陽性的單核細胞和大于三個核的破骨細胞均減少(圖5D～E)。

注:A:熒光顯微鏡檢測FAM siRNA轉染MLO-Y4細胞的效率;B:qPCR檢測RANKL si-RNA的沉默效率;C:ELISA檢測MLO-Y4外泌體中RANKL蛋白的濃度;D:TRAP染色;E:TRAP陽性細胞(紅色)計數。n=3, 與MLO-Y4-Exo組比較,*P<0.05;與siNC-MLO-Y4-Exo組比較,#P<0.05。

3 討論

骨細胞是一種古老的細胞,最早發現存在于奧陶紀無頜魚類中,是骨骼中數量最多的細胞,因為骨細胞包埋在堅硬的礦化基質中,極難接近和獲取,也是研究最少的細胞。自從骨細胞從鈣化骨基質中的分離成為可能[11],骨細胞相關的研究越來越多,這些細胞的功能才逐漸為人所知。本研究通過提取骨細胞樣細胞MLO-Y4的外泌體,在體外實驗證實其具有促進破骨細胞分化的能力,小鼠顱骨皮下注射MLO-Y4-Exo也顯示破骨細胞數量增加。共培養細胞RANKL免疫熒光和顱骨組織免疫組化結果都證實增多的破骨細胞數量和RANKL高表達有關,通過小干擾RNA技術降低MLO-Y4細胞中RANKL表達,MLO-Y4-Exo對破骨細胞分化的促進作用也隨之被逆轉,說明MLO-Y4-Exo通過向破骨前體細胞傳遞RANKL促進其向破骨細胞分化。

MLO-Y4是第一個應用于骨細胞樣研究的細胞系,從在骨鈣素啟動子控制下表達永生化T抗原的轉基因小鼠中獲得高度機械敏感性。截至2019年已有270多篇出版物使用MLO-Y4細胞系來研究骨細胞功能[30]。MLO-Y4細胞同原代骨細胞,高表達RANKL,具有支持破骨細胞形成和激活的功能[9]。通過對無骨細胞的轉基因小鼠血漿外泌體和MLO-Y4細胞衍生外泌體之間的miRNA表達水平的比較,證實循環骨細胞的外泌體中包含的miRNA在MLO-Y4細胞外泌體中富集[31]。所以,本研究選用的MLO-Y4細胞具有骨細胞代表性。

本研究的創新點之一是證實了骨細胞外泌體對破骨細胞分化的調控作用。破骨細胞介導的骨吸收與成骨細胞介導的骨形成處于耦合狀態以維持骨穩態,成骨細胞和破骨細胞之間的平衡關系對健康骨骼的發展至關重要,骨細胞作為骨骼中含量最多、壽命最長的細胞,其對成骨細胞和破骨細胞的雙重調控作用具有重要意義。本課題組前期研究顯示骨細胞脫細胞基質不僅具有促骨生成的作用,同時具有促進破骨細胞分化的作用[11],這有利于骨健康,在吸收舊骨同時形成新骨,維持骨骼健康狀態。本研究發現了骨細胞通過外泌體調控破骨細胞,進而證明骨細胞對骨穩態的重要調控作用。

其次,骨細胞深埋于骨基質中,骨細胞如何調控破骨細胞還缺乏相關證據。一項研究表明,衰老導致的皮質骨流失中,骨細胞分泌的RANKL是必要條件,展現了骨細胞對破骨細胞直接調控的證據[32]。盡管有實驗證實骨細胞分泌RANKL,對破骨細胞的調控起到至關重要的作用[33];但骨細胞深埋于骨基質中,骨細胞分泌的RANKL如何調控破骨細胞還未闡明。但有研究證明,骨細胞嵌在腔隙-小管系統中,小管直徑約210～260 nm[34-35]。所以骨細胞分泌的RANKL可能通過外泌體的方式,經過骨細胞小管系統,帶出骨基質,然后參與周圍破骨細胞調控。這一新的調控方式為防治骨質疏松及骨代謝機制提供有力基礎和新的研究思路。

本研究證實,骨細胞系MLO-Y4來源的外泌體通過向破骨前體細胞傳遞促破骨細胞分化因子RANKL來促進破骨細胞生成。