Vaspin對去卵巢大鼠骨質疏松的保護作用及機制研究

王宏偉 卜曉潔 戰祥芹 陳福蓮 王燕 楊延民*

1.山東省日照市人民醫院保健/老年醫學科,山東 日照 276800

2.山東省濰坊市益都中心醫院,山東 濰坊 262500

3.山東第一醫科大學第二附屬醫院內分泌科, 山東 泰安 271000

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是由于長期雌激素缺乏導致的骨穩態失調[1]。它是絕經后婦女最常見的骨病,主要表現為骨量減少、骨微結構異常,以及骨折風險增加[2]。POMP及其相關骨折對全球絕經后婦女的健康構成重大威脅[3],導致身體殘疾和生活質量下降[4]。統計數據顯示,50歲以上的女性有一半容易發生骨質疏松相關骨折,髖部骨折的死亡率與乳腺癌相當,比子宮內膜癌高4倍[5]。先前的研究發現,PMOP主要是卵巢功能下降和雌激素水平下降共同導致的結果,因此雌激素補充被廣泛用作傳統的治療策略。然而,最近的研究表明,激素療法在預防骨折方面并不是很有效,而且可能會增加某些類型癌癥的風險,如乳腺癌和子宮內膜癌[6]。因此,開發更有效、不良反應更小的替代治療藥物是改善PMOP的關鍵。

內臟脂肪組織特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑(Vaspin)是一種新發現的脂肪細胞因子,與骨代謝密切相關。高飛等[7]發現Vaspin可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化。Bao等[8]發現骨關節炎(osteoarthritis, OA)患者血清Vaspin水平明顯低于正常人群,體外實驗證實Vaspin可降低軟骨細胞的炎癥反應。動物實驗證實,關節內注射Vaspin對關節軟骨也有抗炎、抗降解作用[8]。本課題組前期研究發現,腹腔注射重組Vaspin蛋白可改善雄性SD大鼠高脂飲食引起的骨損傷,并在體外促進原成骨細胞向成骨細胞分化[9]。此外,我們之前的臨床研究也發現老年男性骨質疏松癥患者血清Vaspin水平降低,高血清Vaspin水平可能是老年男性骨質疏松癥的保護因素。Tanna等[10]發現絕經后婦女的血清Vaspin水平與股骨頸和髖關節骨密度(BMD)顯著正相關。這些研究表明Vaspin可能代償性增加從而對骨代謝發揮積極的調節作用。然而,目前尚無研究報道Vaspin干預治療對雌激素缺乏引起的PMOP的作用及機制。腹腔注射外源性Vaspin是否對OVX大鼠骨代謝也有保護作用尚不清楚。本研究旨在觀察Vaspin對去卵巢大鼠骨代謝的影響,并探討其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、試劑與材料

實驗動物:16周齡的雌性Sprague-Dawley (SD)大鼠,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號:SCXK(京) 2019-0006],在封閉的SPF級動物房中飼養,飼養條件是12 h的明暗周期,濕度50 %～60 %,溫度23 ℃左右。大鼠可以自由地獲得食物和水。

試劑與材料:重組人Vaspin 蛋白溶液(C192)購自上海近岸蛋白科技有限公司;P1NP 測定試劑盒(貨號CSB-E12774r),OCN測定試劑盒(貨號CSB-E05128r),TRAP測定試劑盒(貨號CSB-E08492 m),CTX-1測定試劑盒(貨號CSB-E12776r),IL-1β ELISA試劑盒(貨號CSB-E08055r),TNF-α測定試劑盒(貨號CSB-E11987r)均購自武漢華美生物技術有限公司;4 %多聚甲醛購自武漢塞維爾生物科技有限公司;反轉錄試劑盒、Trizol 試劑、引物合成、SYBR Premix EX TAQ II試劑盒試劑盒均購自大連寶生物工程公司;RIPA緩沖液購自上海博彩生物科技有限公司;BCA蛋白分析試劑盒購自上海碧云天生物有限公司;PVDF膜購自美國Millipore公司;強化學發光試劑盒購自美國Santa公司;SkyScan-1176 μCT(比利時布魯克公司);動態疲勞實驗機BoseElectroForce?3230(美國博士公司);10×光學顯微鏡(德國 Zeiss公司);實時熒光定量 PCR 儀(LightCycler480,瑞士羅氏公司);實驗用抗體:GAPDH(稀釋比例1∶1 000,51332)、OPG(稀釋比例1∶1 000,#8486 s)及RANKL(稀釋比例1∶1 000,#3959)均購自Cell Signaling (CST)公司;二抗購自Abcam公司;Flurochem Q化學發光成像系統(美國Alpha Innotech公司)。

1.2 方法

1.2.1去卵巢手術構建絕經后骨質疏松模型:適應性喂養2周后,隨機分為模型組和實驗組:模型組分為去卵巢組(OVX)組和假手術組(Sham)組,每組6只,用于驗證OVX 術后 OP 模型構建的成功;實驗組分為Sham 組、OVX組和 OVX+Vaspin組3組,每組10只。術前采用戊巴比妥鈉進行麻醉處理,劑量為50 mg/kg,OVX組采用雙側卵巢切除術建立絕經后骨質疏松模型,Sham組在卵巢周圍切除少量脂肪,術后所有大鼠均在同等條件下單籠飼養,自由飲水、活動,標準大鼠飼料喂養。

1.2.2動物分組及干預治療:術后6周處死模型組大鼠,取一側股骨行microCT檢測,對OVX大鼠OP模型進行驗證,造模成功評價標準:OVX組大鼠BMD峰值較Sham組降低≥2.5 SD(標準差)。造模成功后,OVX+Vaspin組大鼠均每天給予重組人Vaspin蛋白溶液1 μg/kg腹腔注射,Sham組及OVX組給予等量生理鹽水腹腔注射,干預12周后,用戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠,收集血清和骨骼樣本進行分析。

1.2.3骨代謝指標及炎癥因子檢測:采用ELISA試劑盒檢測各實驗組大鼠血清標本中P1NP、OCN、TRAP、CTX、IL-1β和TNF-α的水平。所有操作均嚴格按照各試劑盒說明書進行操作,操作前將所需要的血清樣品、試劑盒及酶標板孔在室溫下平衡1 h,并按照試劑盒說明書配制實驗所需試劑。最后,根據標準品的濃度和OD值,應用Curve Expert軟件繪制標準曲線,然后根據公式分別計算出樣本P1NP、OCN、TRAP、CTX、IL-1β及TNF-α的濃度水平。

1.2.4骨組織學分析:解剖大鼠左側脛骨,用4 %多聚甲醛固定48 h。用10 %的乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣4周。隨后,將骨標本置于乙醇中逐漸脫水,石蠟包埋,二甲苯脫蠟,再用不同濃度乙醇脫水,滴加蘇木精染色3 min,自來水沖洗1 min,1 %鹽酸乙醇分化2 s,自來水沖洗返藍3 min,梯度酒精切片脫水,用伊紅染色液染色1.5 min,骨切片脫水、透明、封片,最后在10×光學顯微鏡下觀察骨切片的視野圖像。

1.2.5骨生物力學分析:取大鼠右側股骨,用鹽水浸泡紗布保持濕潤,-20 ℃保存。采用動態疲勞實驗機進行三點彎曲試驗,以評估骨強度。測量前將骨置于儀器中,置于兩個軸承的中心位置,以確保彎曲軸與加載長軸對準。在2 mm/min的恒定變形速率下,加載5～6 N直至發生斷裂,確定載荷和斷裂參數。記錄數據后,生成載荷-變形曲線,計算最大載荷、最大斷裂負荷、韌性、能量吸收、彈性模量、極限拉伸強度等骨生物力學參數。

1.2.6MicroCT分析:左股骨分離,4 %多聚甲醛固定,75 %乙醇保存。使用Skyscan 1176 μCT掃描儀分析骨質量和骨小梁微結構,掃描精度17.93 μm,掃描旋轉角度180 °,1 mm A1濾波器,掃描電壓70 kV,電流278 μA,曝光時間450 ms;然后將掃描圖像處理成2D和3D圖像。所有3D圖像處理和分析均使用MicroView,v.2.1軟件進行。計算分析骨小梁體積骨密度(Tb.vBMD)、骨小梁體積/總體積(Tb.BV/TV)、骨小梁數(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)和結構模型指數(SMI)。

1.2.7RNA提取和實時定量PCR(qRT-PCR):使用TRIzol試劑從右脛骨標本中提取總RNA,將總RNA溶解在DEPC水中,測定其濃度。取5 μg總RNA,使用Prime Script?RT試劑盒反轉錄為cDNA。采用10 μL反轉錄反應制備總RNA,37 ℃孵育30 min,85 ℃孵育5 min。使用SYBR Premix EX TAQ II試劑盒,在LightCycler480上進行實時PCR。按照說明書進行PCR反應,引物列于表1。PCR條件為93 ℃ 1次循環2 min(初始變性),然后93 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min 40次循環,最后72 ℃延伸5 min。數據分析采用2-△△CT法,以β-actin為內參進行標準化。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.8免疫印跡分析:將大鼠腰椎骨從液氮中取出,用錘子迅速敲碎,放入液氮臼中研磨。使用RIPA緩沖液按說明書提取腰椎骨總蛋白。細胞懸浮在冰冷的RIPA緩沖液中,在冰上裂解10 min,然后以14 000 r/min 離心10 min。含總蛋白裂解液的上清液用BCA蛋白分析試劑盒定量。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將蛋白質分離到10 %聚丙烯酰胺凝膠中,并轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5 %脫脂牛奶封閉1 h后,在4 ℃下用一抗孵育過夜。用TBST緩沖液清洗3次,室溫下二抗孵育1 h。蛋白條帶使用增強化學發光試劑盒進行可視化,并使用Flurochem Q化學發光成像系統進行檢測。以GAPDH作為對照。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 大鼠骨代謝指標和炎性因子比較

與Sham組相比,OVX組血清P1NP和OCN水平顯著降低,TRAP、CTX、IL-1β、TNF-α水平明顯升高(P<0.05)。而與OVX組相比,OVX+Vaspin組血清P1NP和OCN水平顯著升高,TRAP、CTX、IL-1β、TNF-α水平明顯降低(P<0.05),見表1。

2.2 大鼠骨組織形態變化

與Sham組相比,OVX組骨微結構受損,骨小梁數量明顯減少,OVX+Vaspin組與OVX組相比,骨顯微結構明顯改善,骨小梁數量明顯增加,見圖1。

圖1 各組大鼠的骨組織病理學(HE染色10×,標尺:50 μm)

2.3 大鼠骨生物力學變化

與Sham組相比較,OVX組最大負荷、最大斷裂負荷、韌性、能量吸收、彈性模量、最大強度等生物力學參數均明顯受損(P<0.05)。與骨組織學分析一致,OVX+Vaspin組大鼠OVX誘導的骨生物力學損害明顯改善,見表2。

表2 各組大鼠骨代謝指標和炎性因子比較

表3 各組大鼠骨生物力學參數比較

2.4 大鼠Micro CT分析

Micro CT分析顯示,Vaspin干預治療可以保護大鼠免受OVX誘導的骨小梁和皮質骨骨量丟失,股骨干骺端骨小梁三維重建圖像如圖2A所示。骨小梁的定量分析方面,與Sham組相比,OVX組Tb.vBMD、Tb.BV/TV、Tb.N和Tb.Th水平均顯著下降(P<0.05),Tb.Sp和SMI水平顯著升高(P<0.05),而OVX+Vaspin組這些指標在很大程度上得到了改善(P<0.05),見圖2B～2G。

注:與Sham相比,* P<0. 05;與OVX相比,#P<0. 05。

2.5 大鼠骨組織骨代謝相關基因表達水平的變化

與Sham組相比,OVX組骨組織中OPG的mRNA水平顯著降低(P<0.05),而RANKL的mRNA水平顯著升高(P<0.05)。而與OVX組相比,OVX+Vaspin組骨組織中OPG的mRNA水平顯著升高(P<0.05),而RANKL的mRNA水平顯著降低(P<0.05),見圖3A、3B。

圖3 大鼠骨組織骨代謝相關基因及蛋白表達水平的變化

2.6 大鼠骨組織骨代謝相關蛋白表達水平的變化

我們進一步檢測了右脛骨標本中OPG及RANKL的蛋白表達水平,結果與mRNA定量觀察結果一致,見圖3C～3E。

3 討論

去卵巢大鼠模型是目前世界衛生組織(WHO)推薦的POMP最常用的動物模型,該模型能較好地模擬絕經后婦女雌激素缺乏的臨床特征及其對藥物替代治療的反應,對研究大鼠骨質疏松癥的發生過程和病理生理機制非常有利[11]。我們的研究發現,與Sham組相比,OVX組術后12周骨微結構明顯受損,骨小梁數量明顯減少,骨強度明顯下降,說明卵巢摘除后POMP建模成功。Vaspin干預可以通過提高OVX大鼠的骨量和骨密度,改善骨骼微觀結構和生物學特性,從而對OVX誘導的骨質疏松癥具有改善作用。

骨代謝指標是骨形成或骨吸收過程中血液中釋放的生化指標,能準確反映早期全身骨代謝情況,臨床上常用于評價骨質疏松癥的治療效果。P1NP是成骨細胞在骨形成過程中產生的,可以反映膠骨的形成速度。CTX是破骨細胞在骨基質降解過程中產生的碎片和分泌產物,可以反映骨吸收的狀態。血清P1NP和CTX檢測是國際骨質疏松基金會提出的反映骨形成和骨吸收的敏感指標[12]。OCN是一種廣泛應用的骨形成指標。Vaspin的干預可提高OVX大鼠血清P1NP和OCN水平,降低CTX水平,說明Vaspin可在一定程度上促進OVX大鼠骨形成,降低OVX大鼠骨轉化率。

正常骨量的維持依賴于成骨細胞相關骨形成和破骨細胞相關骨吸收之間的動態平衡,當這種穩態因任何原因被破壞時,破骨細胞的骨吸收比成骨細胞更強,導致骨質流失,這也是OP的主要發病機制。既往研究發現雌激素缺乏可導致絕經后婦女破骨細胞分化增加,骨吸收能力增強,近期研究發現炎性細胞因子也參與了PMOP的病理生理機制[13]。研究證實IL-1β和TNF-α可通過激活炎癥信號通路促進骨吸收,抑制骨形成[14]。我們的實驗也證實了OVX組血清中IL-1β和TNF-α水平明顯高于Sham組,說明OVX組大鼠炎癥因子被激活,而Vaspin可以抑制炎癥反應和骨吸收,降低骨代謝的高轉換水平,從而在一定程度上起到抗骨質疏松的作用。

骨的生物力學分析是評價骨強度和抗骨質疏松藥物療效的黃金指標[15],而骨小梁的微觀結構通常被認為是預測骨量丟失和結構破壞最理想的指標[16]。Micro CT可為股骨干干骺端骨小梁的顯微結構提供直觀、定量的數據。通過三維重建和三維圖像,不僅可以更直觀地觀察骨小梁的結構,還可以通過Tb.vBMD、Tb.BV/TV、Tb.N和Tb.Th等定量數據更準確地檢測骨小梁參數的細微變化。因此Micro CT獲得的數據對于骨質疏松癥的診斷和治療更加具體和全面[17]。我們的研究也證實了OVX大鼠骨生物力學性能下降,骨微觀結構受損,而Vaspin干預可以改善骨生物力學性能,改善骨微觀結構,并在骨組織中產生新的骨小梁。

在骨組織中,骨保護素(osteoprotectin, OPG)主要由成骨細胞產生,進一步促進成骨細胞的分化和成熟。目前研究發現OPG對破骨細胞有直接的負向調節作用[18]。OPG/RANKL/RANK信號通路是參與骨代謝和骨質疏松的主要信號通路,也是目前研究的熱點。有研究發現OPG/RANKL/RANK信號通路部分分子通路的改變直接參與了POMP的病理生理過程[19-21]。我們的研究發現,Vaspin干預OVX大鼠12周后,骨組織中OPG mRNA水平和蛋白水平均升高,而RANKL表達的mRNA和蛋白水平均下降。提示Vaspin對OVX組大鼠骨質疏松的保護作用可能是通過激活OPG/RANKL信號通路介導的,為我們今后進一步的細胞實驗提供了方向。

由于實驗條件限制,本研究未在體外進一步證實Vaspin對OPG/RANKL信號通路表達及相關下游因子的影響。在接下來的研究中,我們將在細胞實驗中加入OPG/RANKL信號通路抑制劑,觀察Vaspin對其下游相關基因蛋白表達的影響,并進一步研究其相關分子機制。

綜上所述,我們的研究證實Vaspin可以促進OVX大鼠骨形成,抑制炎癥反應,抑制破骨細胞分化,優化骨形成和骨吸收的動態平衡,改善骨微觀結構和骨強度,從而在體內發揮抗骨質疏松的作用,而這種作用可能是通過上調OPG表達和下調RANKL表達介導的。因此,在未來的研究中,我們將通過體外細胞實驗進一步驗證Vaspin對OPG/RANKL通路的調控作用。